Biologia dello sviluppo - Apoptosi

In condizioni normali, le proteine anti-apoptotiche si trovano associate al mitocondrio, dove

inibiscono l’attività delle proteine pro-apoptotiche. Quando è indotta l’apoptosi, le PRO

vengono attivate: per esempio, Bak trasloca dal citoplasma alla membrana esterna, dove

forma eterodimeri con Bcl-2, inibendone l’attività, e stesso tempo si associa con Bax per

formare omodimeri che provocano la formazione di pori sulla membrana, i quali permettono

la fuoriuscita di materiale dal mitocondrio al citoplasma.

All’interno del mitocondrio si trova il Citocromo c, utilizzato nella catena respiratoria:

quando fuoriesce nel citoplasma si associa con la proteina Apaf1 (apoptotic protein activated

factor) per formare l’apoptosoma, un monoenzima eptamerico, formato da 7 Apof1, ciascuna

legata ad un Cyt-c.

Struttura Apaf1 è una proteina molto grande, formata da 3 domini:

1. CARD – estremità amminoterminale. È il dominio di reclutamento delle caspasi.

2. Ced 4 – dominio di legame dell’ATP

3. WD-40 – estremità carbossiterminale per le interazioni proteiche.

Normalmente questa proteina è in uno stadio inattivo, dove il dominio CARD e WD-40

interagiscono per formare una struttura chiusa: in questo modo il dominio CARD non può

reclutare le caspasi.

La proteina si attiva quando il citocromo c è liberato dal mitocondrio: il Cyt c lega il dominio

WD-40, producendo un cambio conformazionale che libera il dominio CARD, permettendogli

di interagire con la caspasi 9 (iniziatrice). Caspasi

Sono proteine comuni ad entrambe i pathway. Sono proteasi a cisteina (C): hanno nel loro sito

attivo una Cys che rappresenta l’amminoacido catalitico che tagliano le proteine in siti

bersaglio, in corrispondenza di un Acido aspartico (AS).

Sono formate da un dominio proteasico con due subunità, una grande e una piccola.

Famiglia di 14 proteine, divise in due gruppi:

Caspasi iniziatrici: agiscono all’inizio dell’apoptosi e sono il gruppo più ampio. In

• condizioni normali sono in forma di monomeri inattivi.

Caspasi effettrici: vengono attivate dalle iniziatrici. In forma di dimeri inattivi, con una

• subunità grande e una piccola.

Sono state raggruppate ulteriormente in tre gruppi sulla base della similarità in sequenza.

In condizioni normali, nelle cellule vive, le caspasi devono essere mantenute in uno stato

inattivo dato che sono proteasi. Nella forma inattiva vengono definite pro-caspasi, perché al

dominio proteasico è unito un pro-dominio che si trova nella porzione N-terminale: è di

grandi dimensioni nelle iniziatrici e di piccole dimensioni nelle effettrici. Il pro-dominio a sua

volta è formato da vari motivi proteici, come DED (dominio effettore di morte).

L’attivazione avviene in seguito ad un taglio proteolitico sulla caspasi, nella regione di confine

tra pro-dominio e dominio. Infatti in questa regione di legame, sono presenti residui di acido

aspartico, e il taglio è effettuato da una caspasi iniziatrice: le iniziatrici si attivano da sole e a

loro volta attivano le esecutrici che si uniscono per formare un enzima tetramerico attivo, da

4 subunità. Attivate, le caspaci effettrici andranno a tagliare le proteine bersaglio, che si

trovano nella cellula. Il taglio darà origine a cambiamenti morfologici.

Bersagli delle caspasi:

Attivate disassemblano le proteine del citoscheletro che compongono i microtubuli.

⇒ Agiscono sulla fosfatidilserina, che normalmente si trova all’interno della membrana ma in

seguito al taglio del citoscoletro, viene esposta sulla superficie della membrana plasmatica

in modo da permettere ai macrofagi di riconoscere la cellula apoptotica.

Altro bersaglio sono le DNasi, che tagliano il DNA. In generale le DNAasi in una cellula sono

⇒ inattive ma l’attivazione delle caspasi le attiva.

Es CAD (DNasi attivata dalle caspasi): in condizioni normal è inattivata dall’interazione

con l’inibitore iCAD. Le caspasi effetrici tagliano iCAD e permettono a la DNasi di

traslocare nel nucleo e frammentare il DNA. Cambiamenti morfologici

Cambiamenti al citoplasma

Perdita dei contatti cellulari con le cellule adiacenti.

• Il disassemblamento del citoscheletro porta alla condensazione del citoplasma.

• Riduzione del volume cellulare

•

Cambiamenti al nucleo

Disgregazione dell’involucro nucleare;

• Condensazione della cromatina in tipici aggregati granulari;

• Frammentazione della cromatina;

•

La cellula mantiene la sua normale permeabilità, in modo che non possano fuoriuscire delle

sostanze cellulari che danneggerebbero il tessuto circostante. La membrana plasmatica è

esposta ad un particolare fosfolipide, la fosfatidilserina: la sua esposizione è fondamentale

affinché le cellule si differenzino da quelle sane circostanti. Questo fosfolipide permette il

riconoscimento da parte dei macrofagi che frammentano la cellula apoptotica in piccole

vescicole, in modo da non disperderne il citoplasma: i corpi apoptotici vengono poi eliminati

per fagocitosi. Metodi sperimentali per identificare i corpi apoptotici

metodo più semplice per osservare cellule in apoptosi è la microscopia ottica: il DNA dei

àIl

nuclei viene colorato e indotta l’apoptosi per osservarne il fenomeno: i corpi apoptotici

emettono un segnale più luminoso perché la cromatina si sta frammentando.

su gel di agarosio delle cellule in apoptosi: la cromatina è frammentata e ci

àElettroforesi

indica se la cellula è apoptotica.

Tanner: utilizza l’enzima terminal transferase, la transferasi del nucleotide UTP,

àMetodo

che viene inserito sul DNA quando ci sono estremità libere, causate dalla frammentazione di

DNA. La presenza di UTP è evidenziata inserendo un anticorpo secondario fluorescente che

emette un colore verde. Il metodo è utilizzato per identificare le cellule che stanno morendo

per apoptosi in un tessuto.