Biologia Cellulare

Biologia Cellulare

Colture Cellulari:

cellule che crescono in vitro, cioè isolate dal tessuto da cui siamo partiti. Per favorire la coltura in vitro vi sono 3 metodi principali:

1. Coltura d'Organo: viene prelevato un pezzetto dell'organo d'interesse mantenendo l'architettura tridimensionale che quel tessuto aveva nell'organismo in vivo. La struttura non viene quindi disturbata. È un metodo che non darà tante cellule perché la proliferazione di un tessuto ne mantiene la sua organizzazione e una proliferazione minima è solo in periferia del frammento di tessuto. Solo le cellule periferiche riusciranno a beneficiare di sostanze nutritive. Non serve sperimentalmente.

2. Espianto Primario: si conservano sempre frammenti di tessuto (piccoli) che vengono poi fatti aderire ad un supporto. Si verifica poi una migrazione dal centro della periferia e iniziano a crescere. Queste cellule continueranno la coltura. Metodo lungo con produzione di cellule.

3. Sospensione Cellulare: sospensione a cellule singole partendo dal tessuto. Si scindono le interazioni cellula-cellula portando alla formazione di cellule isolate. Le cellule aderiscono poi ad un supporto dove inizieranno a proliferare.

Quando le cellule iniziano a proliferare si parla di coltura primaria. Una volta avvenuto il primo trasferimento in un contenitore per la crescita, non si parla più di coltura primaria ma di linea cellulare. Come mai le cellule per crescere devono aderire? Le colture cellulari si suddividono in:

1. Colture in Monostrato: quelle colture che per avere proliferazione dobbiamo garantire l'adesione delle cellule al supporto detto anche substrato.

2. Colture in Sospensione: non hanno bisogno di aderire al substrato per proliferare. Derivano da cellule emopoietiche: mantengono anche le caratteristiche che hanno in vivo.

Linea Cellulare:

coltura che continua a crescere dopo il primo passaggio. Si ha un incremento del numero di cellule. Il primo passaggio si effettua quindi, perché il numero delle cellule aumenta e i metaboliti scarseggiano. Le cellule che vengono coltivate non tutte crescono: crescono solo quelle simili tra di loro a livello di adattamento. Man mano che le cellule a coltura vengono trasferite sono sempre più simili tra loro cioè hanno un loro grado di uniformità. Durante il loro trattamento non tutte le cellule sopravvivono e quindi si avranno cellule più resistenti che riusciranno ad adattarsi. Le linee cellulari si distinguono in:

1. Linee Cellulari Finite: dopo un certo numero di generazioni, anche dopo trasferimento su terreno nuovo, non crescono più cioè hanno un numero di generazioni determinato geneticamente. Le linee finite hanno origine da tutte le cellule normali di un organismo.

2. Linee Cellulari Continue: presentano una sopravvivenza illimitata. Questa capacità deriva da un processo detto trasformazione di linee finite. Possono essere coltivate periodicamente in modo illimitato che però può essere associato ad un certo grado di instabilità; devono perciò essere controllate periodicamente.

La trasformazione è una modificazione del fenotipo che deriva da una modificazione del genoma ed è caratterizzata da alcuni punti:

1. Immortalizzazione: la vita delle cellule è illimitata (sempre presente)
2. Controllo Aberrante della Crescita: non subendo più un controllo rigido e regolare quando crescono, le cellule possono non avere l'inibizione da contatto, oppure la densità non inibisce più la proliferazione
3. Malignità: la malignità per essere identificata va dimostrata iniettando le cellule in animali (in vivo) e si dimostra che quelle cellule causano il tumore.

Vedere grafico da slide: EVOLUZIONE DI UNA LINEA CELLULARE, a partire dal prelievo dal tessuto dell'organismo. In ordinate c'è il numero totale di cellule ottenute e in ascisse le settimane.

Inizialmente la curva presenta una caduta nel numero di cellule rispetto a quelle presenti nel tessuto perché i trattamenti che si usano per allestire il campione, sono dannosi e quindi diminuiscono. Quando la coltura primaria parte e si effettua il primo trasferimento, il numero di cellule aumenta in maniera esponenziale per un tempo limitato (della linea cellulare) dipendente dal tipo di cellule. Le linee strategiche indicano un cambiamento di terreno per far crescere le cellule. Se continuiamo a fare questo lavoro ciclico e dopo non succede nulla, si ha senescenza e morte. Se invece si verifica l'evento di trasformazione abbiamo una partenza della crescita con aumento del numero di cellule ottenendo la linea cellulare continua.

ALLESTIMENTO DI UNA COLTURA PRIMARIA

Per far crescere le cellule in vitro da un frammento di tessuto si utilizzano la tecnica dell'espanto primario o la sospensione cellulare ottenuta per disgregazione meccanica o enzimatica.

1. ISOLAMENTO DEL TESSUTO: prelevato in maniera asettica, messo subito in un terreno di coltura andando a dissezionare la zona che ci interessa
2. TECNICA DELL'ESPANTO: frammentare con bisturi il tessuto di partenza e posti in un terreno di coltura con un alta concentrazione di siero bovino. Le cellule contenute nel frammento, migrano alla periferia, aderiscono al contenitore e poi iniziano a proliferare. Se si hanno piccole quantità di tessuto e poca probabilità di perdere le cellule, conviene questa tecnica. Spesso però i frammenti non aderiscono, le cellule che voglio far crescere sono poche.
3. SOSPENSIONE CELLULARE: ottenuta per disgregazione meccanica o enzimatica:
   • - Disgregazione Meccanica: si triturazza il tessuto di partenza con bisturi passandolo attraverso dei setacci (filtrazione) con maglie sempre più strette in modo da eliminare i frammenti e trattenere le cellule singole. Si usano poi degli aghi di calibro decrescente oppure, se il tessuto è molto morbido, si usano delle pipette in modo da favorire la separazione delle cellule. In fine, per ottenere una sospensione di cellule singole, si effettua un'ultima filtrazione con tessuto di nylon con porosità di 40-50 micron: questo ci garantisce che ciò che passa sono cellule singole o aggregati di 2 cellule.
   • - Disgregazione Enzimatica: gli enzimi agiscono a livello delle giunzioni tra cellula-cellula e cellula-matrice. Uno tra i più utilizzati è la tripsina. Viene aggiunta poi una DNAasi che degrada il DNA in quanto esso ha la funzione di far aggregare le altre cellule. Il DNA si può liberare nel mezzo di coltura in seguito a distruzione di alcune cellule sottoposte al trattamento. Una volta che la tripsina ha agito, la possiamo fermare con del tripsin-inibitore oppure aggiungendo una grossa quantità di siero al terreno di coltura. I metodi per impiegare la tripsina sono: la tripsinizzazione a 36,5 °C (o a caldo) facendo agire l'enzima per 30 minuti e poi si inattiva, e la tripsinizzazione a freddo facendo agire tra le 6 e le 24 ore alla temperatura di 4° gradi. Passati il tutto si porta alla temperatura ottimale di lavoro per 20 minuti. Nel secondo caso si ha una forte penetrazione dell'enzima.

Gli altri enzimi si usano