Biochimica industriale 1

Trasporto ai mitocondri

IL 90 % delle proteine mitocondriali sono sintetizzate dal DNA genomico quindi devono

attraversare la doppia membrana mitocondriale.

Il processo di trasporto da citosol al mitocondrio è post-traduzionale. Le proteine prima vengono

completamente sintetizzate sui ribosomi citosolici e poi nel giro di poco tempo le proteine che

devono andare al mitocondrio interagiscono con questo e poi vengono internalizzate.

Ci sono proteine che si fermano nella membrana mitocondriale esterna, quelle che si fermano

nello spazio intermembrana, sulla membrana interna o nella matrice. Il primo passaggio sarà

uguale per tutte e poi si avrà una differenziazione una volta passata la membrana esterna.

Cosa indirizza una proteina al mitocondrio? La sequenza segnale mitocondriale le cui

caratteristiche principali sono:

-sequenza di circa 18 residui localizzata normalmente all’ N-terminale della proteina

-solitamente viene tagliata poi all’ interno della matrice dopo essere stata utilizzata

- non è una sequenza specifica ma è caratterizzata strutturalmente è un alfa elica e ha un

alternanza di residui basici ( che si trovano su una faccia della membrana) e residui idrofobici o

non carichi sull’ altra faccia.

Queste sequenze segnale sono diverse rispetto a quelle che devono andare nel RE.

C è un periodo abbastanza breve di tempo tra il periodo in cui la proteina viene sintetizzata dai

ribosomi citosolici e quello in cui viene captata dai mitocondri, in questo periodo le proteine devono

mantenere una conformazione denaturata, se le proteine assumono una struttura globulare non

riescono a passare attraverso la membrana dei mitocondri. I canali consentono il passaggio di

proteine denaturate e non con conformazione globulare.

Per far si che questo avviene esistono proteine dette chaperoni molecolare, proteine della classe

HSP che interagiscono con la catena polipeptidica e impediscono che la proteina assuma una

conformazione tridimensionale.

Il folding avviene all’ interno del mitocondrio.

I passaggi necessari per portare una proteina nei vari compartimenti:

-proteina che viene sintetizzata nel citosol e ha la sequenza segnale mitocondriale interagisce con

HSP70,poi interagisce sulla membrana mitocondriale esterna con TOM ( Trans locatore della

membrana esterna)

Tutte le proteine che devono entrare nel mitocondrio devono passare per TOM, una volta all’

interno si trovano nello spazio intermembrana.

• Le proteine che si devono fermare nella membrana esterna dette PORINE, sono

solitamente proteine a beta barile e il patway che conduce queste proteine nella membrana

esterna, dopo che sono passate da Tom è una proteina chiamata SAM . SAM prende le

proteine passate da TOM e le porta alla membrana esterna.

• Le proteine possono poi stare nello spazio intermembrana( in questo caso sono gia

arrivate), spesso intervengono le proteine MIA, Chaperoni che assistono nel folding corretto

delle proteine che restano nello spazio intermembrana.

Altre 2 classi devono continuare o per fermarsi nella membrana interna o per essere rilasciate

nella matrice. Di questo aspetto si occupano proteine dette:

• TIM sono le proteine che assistono questa parte: TIM 22 si occupano di portare le proteine

alla membrana interna mentre TIM23 rilascia le proteine solubili nella matrice del

mitocondrio.

TOM è la proteina comune poi si dipartono le vie.

Esistono delle sequenze segnale secondarie che vengono rilevate dopo che viene tolta la prima,

per indirizzare in maniera + specifica la proteina.

Quando noi andiamo a definire dei patways, delle vie in cui più eventi si susseguono in maniera

definita dobbiamo seguire un ordine, il modo in cui arriviamo a definire questi processi si può

basare su 2 approcci combinati

• Approcci di tipo biochimica: mi permettono di valutare specificasmente cosa succede a un

nutriente o una sostanza. Mi permette di seguire cosa succede a una sostanza durante la

sua maturazione . Questo mi consente di chiarire cosa sto studiando, se devo studiare un

metabolita uso un precursore marcato e seguo il pezzo marcato e vedo in che composti si

trova in funzione del tempo. La stessa cosa la posso fare per una proteina, posso marcare

un pezzo di questa e seguire come varia in termini di dimensioni, composizione e

localizzazione.

• Approcci sperimentali: Posso ossevare mediante microscopia elettronica o mediante saggi

indiretti:

ESPERIMENTO fatto per rispondere a una specifica domanda : l’ attraverso delle 2

membrane esterna e interna avviene in maniera contemporanea o prima attraversa la

prima, si ferma nello spazio intermembrana e poi attraversa la seconda successivamente.

Ho un sistema in grado di sintetizzare una proteina solubile mitocondriale marcata , per

esempio mediante S35, metto in contatto la proteina marcata con il nostro mitocondrio,

appena questi entrano in contatto abbasso a 5 ° la temperatura per congelare la situazione

e poi

-taglio con delle proteasi: aggiungo all’ esterno delle proteasi che quindi taglieranno solo le

proteine o le parti di queste che si trovano all’ esterno della membrana del mitocondrio.

-Poi porto a 25° e aggiungo di nuovo le proteasi: in questo secondo caso abbiamo dato

modo alle proteine di continuare il percorso e quindi di entrare nella matrice. A questo punto

aggiungo proteasi e detergente che mi rompe le membrane mitocondriali e mi espone all’

esterno quello che era all’ interno e le proteine possono essere frammentate perche le

proteine si trovano all’ esterno avendo rotto le membrane.

RISULTATI:

A 5° se la sequenza segnale si trova all’ interno della matrice, è associata al mitocondrio

mentre ho tagliato e trovo solubile, in pezzettini parte della radioattività associata alla

proteina che si trovava all’ esterno vuol dire che contemporaneamente avevo parte della

proteina era fuori ( proteina che ???????può essere tagliata dalla proteasi); viceversa se la

seq segnale io la trovo dentro al mitocondrio e ho una parte di proteina digeribile dalle

proteasi esterne al di fuori vuol dire che ho avuto un’ attraverso della membrana

mitocondriale esterna e una interna che avviene in maniera sequenziale e

contemporaneamente

Lascio a 25° e poi tratto con proteasi, non ottengo nulla che viene tagliato da proteasi

perché le proteine sono già entrate.

Quindi possiamo identificare 2 fasi nella traslocazione:

• Riconoscimento e ancoraggio ( avviene anche a bassa temperatura) dipende anche

dal potenziale di membrana, per capirlo azzero il potenziale di membrana con

farmaci specifici

• Traslocazione a 5° non avviene o viene molto lentamente, richiede idrolisi di ATP

Ho una proteina precursore con sequenza segnale la quale si inserisce in membrana mediante il

complesso TOM, questo consente il passaggio della proteina all’ interno del poro formato dal

complesso TOM e subito dopo se la proteina deve entrare in matrice interagisce con TIM23,

questo avviene quando la proteina non ha ancora finito di passare il complesso TOM. La proteina

sarà in contatto simultaneamente con TOM e con TIM23. L’ attraversamento della membrana è

contemporaneo. La proteina viene traslocata all’ interno della matrice, avviene il taglio della

sequenza segnale che non ci serve + (poi questo verrà degradato per recuperare aa) poi ci sarà il

folding della proteina.

L’ importazione di proteine nella matrice mitocondriale richiede energia in almeno 2 modi:

DIRETTO e INDIRETTO

- l’ interazione e il distacco della proteina HSP70, che mantiene la proteina in conformazione

nativa, avviene tramite l’ idrolisi di ATP, Le proteine HSP70 hanno attività ATPasica intrinseca e

questa viene stimolata durante il ciclo di attacco e di distacco; e dunque si spende energia per

mantenere le proteine in modo disteso. Dispendio di ATP in modo diretto.

-Per mantenere il potenziale di membrana a cavallo tra la matrice e lo spazio intermembrana serve

energia.Il normale potenziale di membrana mitocondriale generato durante il corso dell’ attività

mitocondriale quando abbiamo idrolisi dei nucleotidi prodotti viene dissipato per la sintesi di ATP

ma viene anche utilizzato per assistere alla traslocazione delle proteine. Se si ha l’ azzeramento

del potenziale di membrana si ha anche il blocco della traslocazione delle proteine non nel primo

passaggio ( legame a TOM) ma nei successivi. Utilizzo di ATP indiretto avvalendosi del potenziale

di membrana

-Intervengono le proteine HSP70 che sono presenti sia nel citosol che nel mitocondrio. Le HSP70

presenti nel mitocondrio devono cambiare conformazione utilizzando energia per risucchiare all’

interno le proteine che si trovano nel complesso TIM23. Si utilizza ATP in modo diretto.

Ora faccio passare nel complesso TOM una proteine tipo porina, in questo caso succede che nello

spazio intermembrana dei chaperoni si legano alla struttura non facendole assume struttura

tridimensionale ( chaperonine mantengono la proteina distesa) questa poi interagisce con SAM e

man mano che questa passa la assiste e fa si che questa si pieghi e si inserisca nella

membrana(aiuta ad assumere la conformazione terziaria corretta).

• A-Le proteine possono stare anche nello spazio intermembrana e nella membrana

mitocondriale interna. Per le proteine che si fermano nelle membrane spesso presentano

delle seguenze dette STOP transfer sequence. Quando queste sequenze arrivano all’

interno della membrana bloccano il processo di traslocazione nella membrana. La proteina

ha 2 sequenze segnale, la prima viene tagliata appena entrata nel mitocondrio, la seconda

se è una stop transfert sequence fa si che la proteina si alloggi nella membrana

mitocondriale interna.

• A2-Una cosa simile può avvenire se noi abbiamo bisogno di avere una proteina che sia

solubile e che stia nello spazio intermembrana. La proteina subisce un taglio proteolitico

che toglie la stop transfert sequence e la proteina viene liberata nello spazio

intermembrana.

• B-Le proteine che sono sintetizzate nel mitocondrio e che devono andare nella membrana

interna:queste possono interagire con il complesso OXA e dall’ interno vanno verso l’

esterno, dopo aver interagito con OXA, la seq stop transfert blocca la proteina e la lascia

legata alla membrana mitocondriale interna che guarda nello spazio intermebrana.

• Le proteine di membrana interna possono arrivare mediante il primo meccanismo

A( proteine sintetizzate nel citosol), B ( proteine sintetizzate nel mitocondrio)oppure con un

modello ibrido tra i 2 ( per le proteine sintetizzate nel citosol. La proteina interagisce con il

complesso TOM, viene tolta la seq segnale all’ interno della matrice (abbiamo fatto un

intera traslocazione) e a questo punto grazie al sistema OXA la proteine che contiene una

seconda sequenza segnale sarà del tutto equivalente a quella prodotta nel mitocondrio.

[Porto la proteina dal citosol alla matrice, stacco la prima sequenza segnale e trovo una seconda

seq segnale di stop transfert sequence: fa la stessa via di una proteina sintetizzata nel

mitocondrio]

• Proteine di membrana interna che devono attraversare + di una volta la membrana interna.

Ho un'unica alfa elica che si trasferisce in membrana ( il resto della proteina è fuori), ho il

passaggio della proteina mediante il complesso TOM, interazione con le chaperonine,

interazione con TIM 22 che mi fa inserire in modo corretto le proteine che si devono

localizzare nella membrana interna e devono attraversare + volte la membrana.

Abbiamo dunque una serie di meccanismi diversi che valgono sia per proteine sintetizzate nel

citosol, sia per proteine sintetizzate nel mitocondrio.

Le proteine che si trovano nel sistema membranoso della cellula. Il sistema membranoso è

composto dal RE, dal Golgi, e dal Golgi verso la superficie cellulare abbiamo le vescicole e dalla

superficie cellulare al golgi abbiamo gli endosomi.

Trasporto dal citosol ai reticolo endoplasmatico

Il reticolo ha una zona luminale e una zona esterna( c è una parte del reticolo a cui sono legati

fortemente i ribosomi ( RER) mentre il REL non ha ribosomi legati). I 2 sono distinti da un punto di

vista funzionale. Il processamento delle proteine nel RE avviene solo da parte del RER poichè il

processo di processamento è COTRADUZIONALE.

Il sistema tubulare è un sistema molto dinamico.

Punti principale del processo di traslocazione delle proteine nel reticolo, il processo è + complicato

se si tratta di proteine che hanno molti domini trans-membrana.

E’ utile sapere come studiare questo in sistemi biochimici ricostruiti: traslocazione di una proteina

in un organello.

Proteina che ha una specifica sequenza segnale. La proteina marcata è ottenuta mediante un

processo di trasduzione in vitro con un nucleotide marcato ( ho un singolo messaggero).

Se il sistema viene complicato aggiungendo degli organelli ( ex. il RE) posso vedere la sintesi

proteica separando le proteine dal resto ( precipitandole con acido tricloroacetico e poi filtrandole e

contando la radioattività )oppure valutare che tipo di proteine sono stata marcate usando una

SDSpage per separare le proteine e vedere quali specie proteiche sono marcate.

Faccio lo stesso esperimento in presenza e in assenza del RE,faccio avvenire la traduzione,lascio

un po’ di tempo per far maturare le proteine e successivamente carico le proteine su un gel ed

espongo il gel ad un autoradiografia. Io vedrò solo le proteine marcate nel nostro sistema.

Ottengo: una singola specie proteica , quella codificata dall’ mRNA aggiunto da me ,ma la proteina

posta in assenza del RE ha una massa molecolare maggiore rispetto a quella che ha il RE. Questo

vuol dire che la proteina sintetizzata con il RE è stato tolto un segmento: la sequenza segnale

specifica che guida la proteina ad assemblarsi sul reticolo.

Nel caso in cui ho aggiunto il RE, se aggiungo una proteasi la proteina non si degrada perché si

trova protetta dal lume del reticolo. Se aggiungo una proteasi ma anche un detergente questa

degraderà la proteina. Con questo tipo di saggi posso capire i componenti necessari per

ricomporre i passaggi.

Quello che si aggiunge nel esperimento in cui è aggiunto il reticolo è la frazione microsomia che è

una frazione del RE che si ottiene in questo modo:

ho il RE , quando omogeneizzo il reticolo questo si frammenta in pezzettini che hanno la tendenza

di formare delle sferette che possono essere poi separate per centrifuga e usate in esperimenti

come il precedente.

Il processo che avviene per il processamento delle proteine nel RER è un processamento CO-

traduzionale.

I ribosomi quando traducono, traducono in polisomi in cui diversi ribosomi sono attaccati allo

stesso mRNA

Esistono 2 pool di ribosomi:

Ribosomi solubili e ribosomi del RE, questi 2 ribosomi hanno le stesse sub unità, quello che

cambia è che i ribosomi che sintetizzano proteine di membrana si legano al SRP ( particella di

riconoscimento delle proteine segnale) che a sua volta interagisce con un recettore in modo tale

da formare un complesso. E’ le seq segnale del ribosoma che determinerà se questo diventerà un

ribosoma attaccata al reticolo.

Guenter Blobel, nobel prize 1999 per la scoperta dei segnali intrinseci delle proteine che

governano il trasporto e destinazione all’ interno della cellula.

La gran parte delle proteine che entrano al RE entrano attraverso un meccanismo CO-

traduzionale: i ribosomi che stanno traducendo delle proteine di membrana, che devono essere

secrete all’ interno del lume del RE o al di fuori della cellula, devono mettersi in contatto con il RE.

Il riconoscimento dei ribosomi con le proteine del reticolo è permesso dalla sequenza segnale che

si trova all’ estremità N-terminale della sequenza e quindi trovandosi all’ N term è la prima parte

della proteina che spunta dal ribosoma mentre viene tradotta.

Esiste un sistema che consente alle proteine che hanno questa sequenza di interagire con il

reticolo, questo sistema necessita 2 elementi:

-Fattore solubile: SRB: particella di riconoscimento della seq segnale, che funziona come

adattatore che consente al ribosoma che contiene al N-term della proteina che sta traducendo la

seq segnale di interagire con il secondo fattore: il recettore sulla membrana del RE.

La SRB è in grado di legarsi con la sequenza segnale e il ribosoma da una parte e con il recettore

dall’ altro.

Successivamente la SRB si stacca, non è + necessaria quando il complesso si viene a trovare in

prossimità di un poro che consente alla proteina nascente di entrare all’ interno del canale e

entrare all’ interno del reticolo.

I primi elementi di cui dobbiamo occuparci sono l’ SRB e il recettore che si trova sul RE

La sequenza segnale è l’ elemento proteico che consente il riconoscimento con SRB

-si trovano all’ N-term

-Contiene una zona centrale idrofobica( H)

-La zona N-term ha dei residui che contengono almeno un residuo carico

positivamente( basico )

-Tratto C-term di 3-7 residui neutri ma polari ( hanno cariche parziali)

L’ ultimo residuo solitamente è un residuo piccolo e neutro come Gly, Ala, Ser, Treonina.

La zona che divide la seq segnale dalla parte che sta a valle della seq segnale è importante

perché e’ il sito di taglio per la peptidasi del segnale,enzima proteolitico che deve avere una

certa specificità, deve tagliare in punti specifici della sequenza. Questa riconosce l’ intorno del

sito di taglio( solitamente viene riconosciuta la zona a monte del sito di taglio).

Deve avere una certa specificità, deve intervenire in punti specifici della sequenza.

Le seq segnale per il RE sono solitamente all’ N-term ma possono essere interne e queste

possono consentire alla proteina di stare in membrana .

I segnali di eucarioti e procarioti sono funzionalmente simili,

• Come faccio a verificare se una seq. segnale è necessaria e sufficiente per la

traslocazione?

La seq segnale è necessaria se togliendo questa in una proteina normalmente secreta, questa

proteina non sar&agr