Biochimica industriale 1

Trasporto ai mitocondri

Il 90% delle proteine mitocondriali sono sintetizzate dal DNA genomico, quindi devono attraversare la doppia membrana mitocondriale. Il processo di trasporto da citosol al mitocondrio è post-traduzionale. Le proteine prima vengono completamente sintetizzate sui ribosomi citosolici e poi, nel giro di poco tempo, le proteine che devono andare al mitocondrio interagiscono con questo e vengono internalizzate.

Ci sono proteine che si fermano nella membrana mitocondriale esterna, quelle che si fermano nello spazio intermembrana, sulla membrana interna o nella matrice. Il primo passaggio sarà uguale per tutte e poi si avrà una differenziazione una volta passata la membrana esterna.

Sequenza segnale mitocondriale

Cosa indirizza una proteina al mitocondrio? La sequenza segnale mitocondriale le cui caratteristiche principali sono:

• Sequenza di circa 18 residui localizzata normalmente all'N-terminale della proteina.
• Solitamente viene tagliata poi all'interno della matrice dopo essere stata utilizzata.
• Non è una sequenza specifica ma è caratterizzata strutturalmente: è un'alfa elica e ha un'alternanza di residui basici (che si trovano su una faccia della membrana) e residui idrofobici o non carichi sull'altra faccia.

Queste sequenze segnale sono diverse rispetto a quelle che devono andare nel RE. C'è un periodo abbastanza breve di tempo tra il periodo in cui la proteina viene sintetizzata dai ribosomi citosolici e quello in cui viene captata dai mitocondri. In questo periodo le proteine devono mantenere una conformazione denaturata; se le proteine assumono una struttura globulare non riescono a passare attraverso la membrana dei mitocondri. I canali consentono il passaggio di proteine denaturate e non con conformazione globulare.

Proteine chaperoni molecolare

Per far sì che ciò avvenga, esistono proteine dette chaperoni molecolare, proteine della classe HSP, che interagiscono con la catena polipeptidica e impediscono che la proteina assuma una conformazione tridimensionale. Il folding avviene all'interno del mitocondrio.

Passaggi di trasporto nei compartimenti mitocondriali

I passaggi necessari per portare una proteina nei vari compartimenti:

• La proteina, sintetizzata nel citosol e con la sequenza segnale mitocondriale, interagisce con HSP70.
• Interagisce sulla membrana mitocondriale esterna con TOM (Trans locatore della membrana esterna). Tutte le proteine che devono entrare nel mitocondrio devono passare per TOM. Una volta all'interno, si trovano nello spazio intermembrana.
• Le proteine che devono fermarsi nella membrana esterna, dette porine, sono solitamente proteine a beta barile. Il pathway che conduce queste proteine nella membrana esterna, dopo essere passate da TOM, è una proteina chiamata SAM. SAM prende le proteine passate da TOM e le porta alla membrana esterna.
• Le proteine possono poi stare nello spazio intermembrana (in questo caso sono già arrivate), spesso intervengono le proteine MIA, chaperoni che assistono nel folding corretto delle proteine che restano nello spazio intermembrana.

Altre due classi devono continuare per fermarsi nella membrana interna o per essere rilasciate nella matrice. Di questo aspetto si occupano proteine dette:

• TIM: TIM 22 si occupa di portare le proteine alla membrana interna, mentre TIM23 rilascia le proteine solubili nella matrice del mitocondrio. TOM è la proteina comune, poi si dipartono le vie.

Esistono delle sequenze segnale secondarie che vengono rilevate dopo che viene tolta la prima, per indirizzare in maniera più specifica la proteina.

Approcci per definire i pathway

Quando definiamo dei pathway, delle vie in cui più eventi si susseguono in maniera definita, dobbiamo seguire un ordine. Il modo in cui arriviamo a definire questi processi può basarsi su due approcci combinati:

• Approcci di tipo biochimico: permettono di valutare specificamente cosa succede a un nutriente o una sostanza e seguire cosa succede a una sostanza durante la sua maturazione.
• Approcci sperimentali: osservazione mediante microscopia elettronica o mediante saggi indiretti.

Esperimento fatto per rispondere a una specifica domanda: l'attraversamento delle due membrane, esterna e interna, avviene in maniera contemporanea o prima attraversa la prima, si ferma nello spazio intermembrana e poi attraversa la seconda successivamente.

Ho un sistema in grado di sintetizzare una proteina solubile mitocondriale marcata, per esempio mediante S35. Metto in contatto la proteina marcata con il nostro mitocondrio, abbasso a 5° la temperatura per congelare la situazione e poi taglio con delle proteasi: aggiungo all'esterno delle proteasi che quindi taglieranno solo le proteine o le parti di queste che si trovano all'esterno della membrana del mitocondrio. Poi porto a 25° e aggiungo di nuovo le proteasi: in questo secondo caso abbiamo dato modo alle proteine di continuare il percorso e quindi di entrare nella matrice. A questo punto aggiungo proteasi e detergente che mi rompe le membrane mitocondriali e mi espone all'esterno quello che era all'interno e le proteine possono essere frammentate perché le proteine si trovano all'esterno avendo rotto le membrane.

Risultati

A 5° se la sequenza segnale si trova all'interno della matrice, è associata al mitocondrio mentre ho tagliato e trovo solubile, in pezzettini, parte della radioattività associata alla proteina che si trovava all'esterno, vuol dire che contemporaneamente avevo parte della proteina era fuori (proteina che può essere tagliata dalla proteasi); viceversa se la sequenza segnale io la trovo dentro al mitocondrio e ho una parte di proteina digeribile dalle proteasi esterne al di fuori, vuol dire che ho avuto un'attraversamento della membrana mitocondriale esterna e una interna che avviene in maniera sequenziale e contemporaneamente.

Lascio a 25° e poi tratto con proteasi, non ottengo nulla che viene tagliato da proteasi perché le proteine sono già entrate.

Fasi nella traslocazione

Quindi possiamo identificare due fasi nella traslocazione:

• Riconoscimento e ancoraggio (avviene anche a bassa temperatura) dipende anche dal potenziale di membrana, per capirlo azzero il potenziale di membrana con farmaci specifici.
• Traslocazione a 5° non avviene o viene molto lentamente, richiede idrolisi di ATP.

Ho una proteina precursore con sequenza segnale la quale si inserisce in membrana mediante il complesso TOM. Questo consente il passaggio della proteina all'interno del poro formato dal complesso TOM e subito dopo, se la proteina deve entrare in matrice, interagisce con TIM23. Questo avviene quando la proteina non ha ancora finito di passare il complesso TOM. La proteina sarà in contatto simultaneamente con TOM e con TIM23. L'attraversamento della membrana è contemporaneo. La proteina viene traslocata all'interno della matrice, avviene il taglio della sequenza segnale che non ci serve più (poi questo verrà degradato per recuperare aminoacidi) e poi ci sarà il folding della proteina.

Importazione di proteine nella matrice mitocondriale

L'importazione di proteine nella matrice mitocondriale richiede energia in almeno due modi: diretto e indiretto.

• L'interazione e il distacco della proteina HSP70, che mantiene la proteina in conformazione nativa, avviene tramite l'idrolisi di ATP. Le proteine HSP70 hanno attività ATPasica intrinseca e questa viene stimolata durante il ciclo di attacco e di distacco; dunque si spende energia per mantenere le proteine in modo disteso. Dispendio di ATP in modo diretto.
• Per mantenere il potenziale di membrana a cavallo tra la matrice e lo spazio intermembrana serve energia. Il normale potenziale di membrana mitocondriale, generato durante il corso dell'attività mitocondriale quando abbiamo idrolisi dei nucleotidi, viene dissipato per la sintesi di ATP ma viene anche utilizzato per assistere alla traslocazione delle proteine. Se si ha l'azzeramento del potenziale di membrana si ha anche il blocco della traslocazione delle proteine non nel primo passaggio (legame a TOM) ma nei successivi. Utilizzo di ATP indiretto avvalendosi del potenziale di membrana.

Intervengono le proteine HSP70 che sono presenti sia nel citosol che nel mitocondrio. Le HSP70 presenti nel mitocondrio devono cambiare conformazione utilizzando energia per risucchiare all'interno le proteine che si trovano nel complesso TIM23. Si utilizza ATP in modo diretto.

Processo di trasporto delle porine

Ora faccio passare nel complesso TOM una proteina tipo porina. In questo caso succede che nello spazio intermembrana dei chaperoni si legano alla struttura non facendole assumere struttura tridimensionale (chaperonine mantengono la proteina distesa). Questa poi interagisce con SAM e man mano che questa passa, la assiste e fa sì che questa si pieghi e si inserisca nella membrana (aiuta ad assumere la conformazione terziaria corretta).

Proteine nello spazio intermembrana e membrana interna

• A - Le proteine possono stare anche nello spazio intermembrana e nella membrana mitocondriale interna. Per le proteine che si fermano nelle membrane, spesso presentano delle sequenze dette STOP transfer sequence. Quando queste sequenze arrivano all'interno della membrana, bloccano il processo di traslocazione nella membrana. La proteina ha due sequenze segnale, la prima viene tagliata appena entrata nel mitocondrio, la seconda, se è una stop transfer sequence, fa sì che la proteina si alloggi nella membrana mitocondriale interna.
• A2 - Una cosa simile può avvenire se abbiamo bisogno di avere una proteina che sia solubile e che stia nello spazio intermembrana. La proteina subisce un taglio proteolitico che toglie la stop transfer sequence e la proteina viene liberata nello spazio intermembrana.
• B - Le proteine che sono sintetizzate nel mitocondrio e che devono andare nella membrana interna: queste possono interagire con il complesso OXA e dall'interno vanno verso l'esterno, dopo aver interagito con OXA, la seq stop transfer blocca la proteina e la lascia legata alla membrana mitocondriale interna che guarda nello spazio intermembrana.

Le proteine di membrana interna possono arrivare mediante il primo meccanismo A (proteine sintetizzate nel citosol), B (proteine sintetizzate nel mitocondrio) oppure con un modello ibrido tra i due (per le proteine sintetizzate nel citosol). La proteina interagisce con il complesso TOM, viene tolta la seq segnale all'interno della matrice (abbiamo fatto un'intera traslocazione) e a questo punto, grazie al sistema OXA, la proteina che contiene una seconda sequenza segnale sarà del tutto equivalente a quella prodotta nel mitocondrio.

Porto la proteina dal citosol alla matrice, stacco la prima sequenza segnale e trovo una seconda seq segnale di stop transfer sequence: fa la stessa via di una proteina sintetizzata nel mitocondrio.

• Proteine di membrana interna che devono attraversare più di una volta la membrana interna. Ho un'unica alfa elica che si trasferisce in membrana (il resto della proteina è fuori), ho il passaggio della proteina mediante il complesso TOM, interazione con le chaperonine, interazione con TIM 22 che mi fa inserire in modo corretto le proteine che si devono localizzare nella membrana interna e devono attraversare più volte la membrana.

Abbiamo dunque una serie di meccanismi diversi che valgono sia per proteine sintetizzate nel citosol, sia per proteine sintetizzate nel mitocondrio. Le proteine che si trovano nel sistema membranoso della cellula. Il sistema membranoso è composto dal RE, dal Golgi, e dal Golgi verso la superficie cellulare abbiamo le vescicole e dalla superficie cellulare al golgi abbiamo gli endosomi.

Trasporto dal citosol al reticolo endoplasmatico

Il reticolo ha una zona luminale e una zona esterna (c'è una parte del reticolo a cui sono legati fortemente i ribosomi, RER, mentre il REL non ha ribosomi legati). I due sono distinti da un punto di vista funzionale. Il processamento delle proteine nel RE avviene solo da parte del RER poiché il processo di processamento è COTRADUZIONALE. Il sistema tubulare è un sistema molto dinamico.

Traslocazione delle proteine nel reticolo

Punti principali del processo di traslocazione delle proteine nel reticolo, il processo è più complicato se si tratta di proteine che hanno molti domini trans-membrana. È utile sapere come studiare questo in sistemi biochimici ricostruiti: traslocazione di una proteina in un organello.

Proteina che ha una specifica sequenza segnale. La proteina marcata è ottenuta mediante un processo di trasduzione in vitro con un nucleotide marcato (ho un singolo messaggero). Se il sistema viene complicato aggiungendo degli organelli (ex. il RE) posso vedere la sintesi proteica separando le proteine dal resto (precipitando con acido tricloroacetico e poi filtrandole e contando la radioattività) oppure valutare che tipo di proteine sono state marcate usando una SDSpage per separare le proteine e vedere quali specie proteiche sono marcate.

Faccio lo stesso esperimento in presenza e in assenza del RE, faccio avvenire la traduzione, lascio un po' di tempo per far maturare le proteine e successivamente carico le proteine su un gel ed espongo il gel a un'autoradiografia. Io vedrò solo le proteine marcate nel nostro sistema. Ottengo: una singola specie proteica, quella codificata dall'mRNA aggiunto da me, ma la proteina posta in assenza del RE ha una massa molecolare maggiore rispetto a quella che ha il RE. Questo vuol dire che la proteina sintetizzata con il RE è stato tolto un segmento: la sequenza segnale specifica che guida la proteina ad assemblarsi sul reticolo.

Nel caso in cui ho aggiunto il RE, se aggiungo una proteasi la proteina non si degrada perché si trova protetta dal lume del reticolo. Se aggiungo una proteasi ma anche un detergente questa degraderà la proteina. Con questo tipo di saggi posso capire i componenti necessari per ricomporre i passaggi. Quello che si aggiunge nell'esperimento in cui è aggiunto il reticolo è la frazione microsomica che è una frazione del RE che si ottiene in questo modo: ho il RE, quando omogeneizzo il reticolo, questo si frammenta in pezzettini che hanno la tendenza di formare delle sferette che possono essere poi separate per centrifuga e usate in esperimenti come il precedente.

Il processo che avviene per il processamento delle proteine nel RER è un processamento CO-traduzionale. I ribosomi quando traducono, traducono in polisomi in cui diversi ribosomi sono attaccati allo stesso mRNA.

Ribosomi e particella di riconoscimento delle proteine segnale

Esistono due pool di ribosomi:

• Ribosomi solubili e ribosomi del RE. Questi due ribosomi hanno le stesse subunità, quello che cambia è che i ribosomi che sintetizzano proteine di membrana si legano al SRP (particella di riconoscimento delle proteine segnale) che a sua volta interagisce con un recettore in modo tale da formare un complesso. È la sequenza segnale del ribosoma che determinerà se questo diventerà un ribosoma attaccato al reticolo.

Guenter Blobel, nobel prize 1999 per la scoperta dei segnali intrinseci delle proteine che governano il trasporto e destinazione all'interno della cellula. La gran parte delle proteine che entrano al RE entrano attraverso un meccanismo CO-traduzionale: i ribosomi che stanno traducendo delle proteine di membrana, che devono essere secrete all'interno del lume del RE o al di fuori della cellula, devono mettersi in contatto con il RE. Il riconoscimento dei ribosomi con le proteine del reticolo è permesso dalla sequenza segnale che si trova all'estremità N-terminale della sequenza e quindi trovandosi all'N-term è la prima parte della proteina che spunta dal ribosoma mentre viene tradotta. Esiste un sistema che consente alle proteine che hanno questa sequenza di interagire con il reticolo, questo sistema necessita di due elementi:

• Fattore solubile: SRB: particella di riconoscimento della seq segnale, che funziona come adattatore che consente al ribosoma che contiene al N-term della proteina che sta traducendo la seq segnale di interagire con il secondo fattore: il recettore sulla membrana del RE.
• La SRB è in grado di legarsi con la sequenza segnale e il ribosoma da una parte e con il recettore dall'altro. Successivamente la SRB si stacca, non è più necessaria quando il complesso si trova in prossimità di un poro che consente alla proteina nascente di entrare all'interno del canale e entrare all'interno del reticolo.

I primi elementi di cui dobbiamo occuparci sono l'SRB e il recettore che si trova sul RE. La sequenza segnale è l'elemento proteico che consente il riconoscimento con SRB. Si trovano all'N-term e contengono una zona centrale idrofobica (H). La zona N-term ha dei residui che contengono almeno un residuo carico positivamente (basico). Tratto C-term di 3-7 residui neutri ma polari (hanno cariche parziali). L'ultimo residuo solitamente è un residuo piccolo e neutro come Gly, Ala, Ser, Treonina. La zona che divide la seq segnale dalla parte che sta a valle della seq segnale è importante perché è il sito di taglio per la peptidasi del segnale, enzima proteolitico che deve avere una certa specificità, deve tagliare in punti specifici della sequenza. Questa riconosce l'intorno del sito di taglio (solitamente viene riconosciuta la zona a monte del sito di taglio). Deve avere una certa specificità, deve intervenire in punti specifici della sequenza. Le seq segnale per il RE sono solitamente all'N-term ma possono essere interne e queste possono consentire alla proteina di stare in membrana. I segnali di eucarioti e procarioti sono funzionalmente simili.

Verifica della necessità della sequenza segnale

Come faccio a verificare se una seq. segnale è necessaria e sufficiente per la traslocazione? La seq segnale è necessaria se togliendo questa in una proteina normalmente secreta, questa proteina non sarà...