Appunti di bioorganica

Appunti di bioorganica

Proteine

Sono 20 gli amminoacidi cosiddetti “proteogenici”, in quanto la natura sfrutta proprio questa ventina di amminoacidi per creare tutte le proteine presenti in natura a noi conosciute. (NB: per l’esame, è bene ricordarsi che tutte le strutture dei venti amminoacidi)

Gruppi di amminoacidi

Possiamo dividere gli amminoacidi in diversi gruppi:

• Non vi sono presenti ulteriori gruppi funzionali. Sono quegli amminoacidi le cui catene laterali vengono utilizzate per le interazioni idrofobiche volte a rappresentare frazioni della proteina che siano apolari.
• Questo gruppo comprende gli amminoacidi che presentano altre catene apolari; in esso, vediamo anche quelli che sono i tre amminoacidi aromatici: la fenilalanina, la tirosina e il triptofano.
• Questo gruppo è importante per quanto riguarda i gruppi laterali, che sono gruppi funzionali. Per esempio, la serina e la treonina hanno dei gruppi alcolici, la cisteina ha un gruppo tiolico ed è molto importante per i ponti disolfuro.
• In questo gruppo vediamo amminoacidi con catene laterali R acide o basiche, ad esempio l’acido aspartico e quello glutammico, che presentano entrambi un acido carbossilico come gruppo R.

Nota: gli amminoacidi sono identificati da una serie di tre lettere oppure da una lettera. Il secondo metodo d’annotazione è molto utilizzato dai chimici, viene utilizzata per descrivere la sequenza amminoacidica di una struttura primaria. L’annotazione a tre lettere è molto più intuitiva e associabile, a differenza di quelle a singola lettera.

Amminoacidi essenziali

Nota: alcuni amminoacidi sono indicati con l’annotazione “essenziale”. Questa definizione non ha a che vedere con la struttura, ma con la biosintesi: alcuni di questi non siamo in grado di sintetizzarli, quindi questo termine si riferisce a quegli amminoacidi che devono essere essenzialmente assunti tramite la dieta. Il termine “amminoacido essenziale” è corrispondente a quello delle vitamine: anch’esse sono sostanze essenziali per la vita, ma che non siamo in grado di produrre e che quindi dobbiamo assumere mangiando. Gli amminoacidi essenziali potevano essere definiti come vitamine, in effetti. La tirosina, ad esempio, non risulta essenziale perché possiamo ricavarla dalla fenilalanina.

Caratteristiche delle catene laterali

In particolare, questi quattro amminoacidi fanno sì che le catene laterali delle proteine possano avere tutta una serie di cariche cationiche e anioniche. Dobbiamo sempre ricordare che, in un equilibrio acido-base, la quantità relativa alle due specie chimiche dipenderà dal pH.

Quindi è bene ricordare che, quando pH > pK_a, preverrà la forma basica. Viceversa, prevarrà la forma acida.

Quelle che vediamo accanto agli amminoacidi, sono le pK_a degli amminoacidi come tali (dove “cat” sta per “catena laterale”).

Esempi di pKa

Prendiamo come esempio l'acido aspartico. Questo amminoacido possiede una pK_a pari a 3.86; ciò vuol dire che a pH 7 lo troveremo come anione, ossia come carbossilato. Quindi, ogni volta che sulla struttura della proteina vi è la presenza di un acido aspartico (ma anche di uno glutammico), dobbiamo ricordare che il suo gruppo di acido carbossilico si troverà in forma anionica. Pertanto i biochimici, come spesso accade, si riferiscono a questo tipo di amminoacidi chiamandoli “glutammato” o “aspartato”.

Lo stesso vale per la lisina: la pK_a è pari a 10.53 pertanto, quando siamo a pH 7 (inferiore a pK_a), preverrà la forma acida, di conseguenza il gruppo amminico si presenterà in forma cationica. A maggior ragione lo stesso discorso lo si può fare sull’arginina: la sua pK_a è pari a 12.48, quindi il suo gruppo è ancora più basico e si troverà sempre in forma protonata.

Curiosità: quando noi strofiniamo con una matita la lana, si forma una carica elettrostatica che altrimenti non si formerebbe con, ad esempio, il cotone. Questo è dovuto al fatto che la lana, formata da proteine, contiene svariate cariche negative o positive. Quindi, sfregando la matita, si creano degli accumuli di carica creando dell’elettricità statica.

Queste cariche positive e negative, presenti sulle proteine, non sono tanto dovute all’estremità carbossi-terminale o ammino-terminale, comunque presenti, ma piuttosto alle catene laterali R. In misura minore, possono essere cariche anche le catene laterali della cisteina e dell’istidina, quest’ultima ha però una pK_a della catena laterale pari a 6.10, quindi tutto sommato a pH 7 prevale la forma basica.

Interazioni biologiche degli amminoacidi

Gli amminoacidi più importanti ai fini dell’attività biologica sono quelli aromatici, che espletano la loro importanza tramite interazioni particolari (come, ad esempio, con piccole molecole che si legano ad essi); ancora di maggiore importanza sono quelli con gruppi funzionali, in quanto implicati nell’attività enzimatica. Di certo, per svolgere un ruolo catalitico, non verranno impiegate la leucina, l’isoleucina o la valina poiché ci devono essere necessariamente dei gruppi che svolgano, ad esempio, il ruolo di catalizzatore acido o basico.

Più interessante dal punto di vista dell’attività enzimatica è sicuramente l’istidina perché ha molteplici funzioni interessanti, lo vedremo più avanti.

Stereochimica degli amminoacidi

Gli amminoacidi di una proteina sono tutti di serie sterica L, hanno tutti configurazione CIP (Chan Inghold e Prelog) S, ad eccezione della cisteina: essa non possiede realmente configurazione R, diciamo che è un’apparenza dovuta alle nostre convenzioni, la configurazione è la stessa degli altri amminoacidi. Questi ultimi possiedono infatti sempre, nella loro struttura, un azoto che possiede priorità 1, un carbossile con priorità 2 e, infine, 3 per quanto riguarda la catena -R (la quarta priorità andrà all’idrogeno alfa). Nella cisteina, invece, il carbossile possiede priorità 3, in priorità 2 invece ci va il -CH₂SH.

Perché? Perché nella Cahn Ingold e Prelog non bisogna confrontare la somma dei numeri atomici degli atomi legati, ma si confrontano le due serie fino al primo punto di differenza. Confrontando le due serie avrò:

• Dapprima C e C
• Poi O O per quanto riguarda il carbossile, invece per quanto riguarda la -CH₂SH avrò una serie SHH

Vince quindi S, che assume maggiore priorità.

Da ricordare anche due amminoacidi che hanno un secondo centro stereogenico: la treonina e l’isoleucina. La serie sterica L è sempre portata nel carbonio che porta l’amminogruppo. Si può fare quindi un distinguo tra i due amminoacidi: la treonina naturale è chiamata L-treonina nonostante il secondo centro stereogenico risulta essere di configurazione D!

Quindi è bene precisare che per gli amminoacidi, non vale la regola secondo la quale una serie sterica è D o L a seconda della configurazione del centro chirale più distante da quello che porta il gruppo principale. Per gli amminoacidi, quando indichiamo una serie sterica, ci stiamo riferendo sempre a quella che porta il gruppo amminico. Questo è un diastereoisomero, ci sarà poi anche la D-allo-treonina.

Lo stesso discorso fatto prima si può fare per l'isoleucina, solo che entrambi i centri stereogenici sono hanno configurazione S.

Struttura delle proteine

Per comprendere com’è costituita una proteina, occorre definire una serie di strutture: la primaria, la secondaria, la terziaria e, nel caso fosse presente, anche la quaternaria. Essa descrive qual è la sequenza degli amminoacidi.

Quando più amminoacidi condensano formando un polimero, essi vanno a costituire quello che è un peptide. Più peptidi insieme vanno a costituire una proteina. Prendiamo l’esempio più semplice: due amminoacidi che vanno a formare un dipeptide. Abbiamo detto che sono 20 gli amminoacidi che in natura vanno a costituire le proteine, pertanto abbiamo 20*20 (400) possibili combinazioni secondo cui gli amminoacidi possono unirsi.

Nota importante: un dipeptide ala-val è diverso da quello val-ala dato che, se ciò non fosse valido, questi due peptidi sarebbero la stessa cosa e l’enorme chemiodiversità delle proteine a partire da soli 20 amminoacidi verrebbe meno. Detto ciò, è ben facile comprendere come con una proteina di soli due amminoacidi si possano avere variazioni enormi. È proprio da questo discorso che si capisce come mai la natura sia riuscita a trovare delle proteine così specifiche per dei ruoli assolutamente essenziali, in quanto ha potuto scegliere tra una gamma enorme.

Da ciò ne consegue che le proteine presenti in natura sono solo una piccolissima frazione di quelle teoriche possibili: sono quelle che evidentemente, nel corso dell’evoluzione, hanno assunto una struttura particolare che le ha rese utili a svolgere una determinata funzione. Tornando al discorso sulla struttura della proteina, la prima cosa che occorre affinché avvenga la caratterizzazione della molecola è determinarne la sua struttura primaria: la sequenza degli amminoacidi. È bene notare che la proteina non è simmetrica, quindi è necessario sapere come scriverla. Per convenzione, si è deciso di descrivere la struttura primaria a cominciare dalla struttura N-terminale per finire all’estremità carbossi-terminale. Anche se non vedessimo questa estremità, come se avessimo una lente che ci fa vedere solo la parte centrale della proteina, riusciremmo comunque a capire se l’abbiamo scritta secondo la convenzione oppure no, proprio a seconda di quale gruppo stiamo incontrando proseguendo verso un senso o verso l’altro.

Questi amminoacidi verranno numerati come 1, 2, 3 e così via. Determinare la sequenza di una struttura primaria, equivale a dire quali amminoacidi sono presenti e in che ordine essi sono disposti. La prima cosa da fare quando si vuole determinare questo tipo di struttura, è stabilire quali amminoacidi siano presenti, assieme alla loro quantità relativa.

Questo naturalmente non aiuta a comprendere la natura e le funzioni di quella proteina, però restituisce l’idea su quali amminoacidi sono presenti e serve soprattutto a stabilire la strategia migliore possibile per i successivi metodi di analisi.

Determinazione della sequenza

• La proteina viene scissa nei suoi amminoacidi: questo processo non è facile, le proteine sono caratterizzate da legami ammidici che sono sì legami idrolizzabili, ma piuttosto stabili. Molte volte la proteina è avvolta su sé stessa, di conseguenza questi gruppi funzionali possono trovarsi “sepolti” (“buried”) all’interno della sua struttura. Di conseguenza, per idrolizzare questi legami ammidici bisogna procedere drasticamente.
• Generalmente, l’idrolisi completa si fa con acido cloridrico 6N a 110 °C. Recentemente è entrato in uso il forno a microonde che consente di raggiungere delle temperature elevate velocemente.
• Il problema di questa idrolisi è che l’asparagina e la glutammina, a queste condizioni, si trasformano in acido glutammico e acido aspartico. Quindi, non è possibile distinguere la presenza di asparagina o di glutammina rispetto all’acido aspartico o all’acido glutammico, in quanto le prime sono le ammine derivanti dai due acidi sopracitati.
• L’idrolisi si opera dopo aver rotto i ponti disolfuro (in quanto complicherebbero l’analisi).
• Si procede con un’analisi quantitativa degli amminoacidi, la tecnica più utilizzata è basata sulla cromatografia a scambio ionico. È una tecnica “fatta in grande”, tuttavia esistono delle varianti miniaturizzate basate sullo stesso concetto.

Cromatografia a scambio ionico

Lo scambio ionico si fa nelle resine, in genere di polistirene contenente dei gruppi funzionali. Il polistirene è fatto in questo modo: esso deriva dallo stirene, che subisce una polimerizzazione tramite l’azione di un iniziatore radicalico. Si forma un radicale benzenico, che va ad attaccare un’altra molecola di stirene su uno dei due carboni del doppio legame, andando a formare un secondo radicale; questo a sua volta andrà ad attaccare un’altra molecola di stirene e così via. Il risultato è l’ottenimento di una catena lineare di atomi di carbonio, in cui alternativamente troviamo legato un fenile.

Questo tipo di struttura si presta molto bene nella cromatografia a scambio ionico, poiché gli anelli benzenici possono essere facilmente “funzionalizzabili” mediante reazione di sostituzione nucleofila aromatica, che sia prima o dopo la polimerizzazione. Inoltre il polistirene si presta molto bene nell’ottenimento di resine con caratteristiche chimico-fisiche precise: quando io polimerizzo lo stirene, mi basta aggiungere una piccola quantità di divinil-benzene per far sì che lo stirene polimerizzi andando a formare quelli che sono i cosiddetti legami “cross linking”, ossia catene che legano fra di loro quelle principali restituendo una maggiore rigidità alla struttura:

Se infatti polimerizzassi lo stirene senza l’utilizzo del crosslinking, quando la resina viene a contatto con un solvente potrebbe rigonfiarsi (può aumentare di volume anche di 3 o 4 volte), risultando poco adatta ad un utilizzo in cromatografia.

Ritornando al discorso sulle versatilità di questi materiali, abbiamo detto che è facile legare alle resine dei gruppi funzionali. Questi possono essere dei gruppi anionici o cationici. I gruppi anionici sono, in generale, del sulfonati: le resine che hanno questo tipo di gruppi vengono dette “resine a scambio cationico”.

Questo perché quando è presente un anione, dev’esserci anche un controione, pertanto quando si comprano queste resine sull’etichetta verrà scritto, ad esempio, “forma Na⁺”, che sta ad indicare il controione. Ci può essere invece anche la dicitura “forma H⁺”, che sta a significare che si trova sotto forma di acido solforico. In questo caso possiamo parlare di resine definite “acide forti”.

Le resine a scambio anionico devono avere invece gruppi cationici. Quello più tipico è un sale di ammonio quaternario. In questo caso, resine del tipo “forma OH^-” vengono definite “resine basiche”. È bene specificare che queste resine possono essere convertite in una forma o in un’altra, supponiamo ad esempio di volere una resina in forma H⁺ partendo da una in forma Na⁺. La metto in una colonna, eluisco una soluzione di acido cloridrico fino a che, piano piano, scende Na⁺ fino a che a un certo punto sono riuscito a trasformare tutto il solfonato di sodio in acido solforico.

Eluizione degli amminoacidi

Vediamo cosa succede se prendo un amminoacido: supponiamo di avere ora la resina in forma H⁺ (ossia a scambio cationico, che è il tipo utilizzato maggiormente per gli amminoacidi) e di metterci un amminoacido, in forma zwitterionica. Quella che avviene è una reazione acido-base che va a protonare l’amminoacido, formando di fatto un catione. L’amminoacido rimane legato alla resina. Quindi, mentre faccio passare la soluzione dell’amminoacido dentro la colonna, mi uscirà dell’acqua, non acida, dal rubinetto.

Adesso, come faccio a far uscire l’amminoacido? Se io eluisco esclusivamente acqua, non c’è alcuna diluizione dell’amminoacido. Per spostare questo equilibrio, mi occorre trasformare l’amminoacido in forma zwitterionica: se ad esempio utilizzassi NaOH ci riuscirei, perché si andrebbe a formare il sale sodico del solfonato. La soluzione che però vado ad utilizzare idealmente è una tampone: più questa soluzione è tampone, più l’amminoacido scenderà velocemente. Di conseguenza la velocità dell’eluizione dipende dal pH (a differenza della cromatografia classica, dove l’eluizione dipendeva invece dalla polarità dell’eluente).

Quindi sto lavorando in “gradiente di tampone”: immagino di fare una cromatografia dove l’eluente scende, mescolandolo coi tamponi opportuni, operando un “gradiente di pH”, ossia: mano a mano che la cromatografia va avanti, il pH aumenta. Alcuni amminoacidi usciranno prima, altri usciranno dopo. Questo dipende dal punto isoelettrico. Avremo quindi diversi casi. Se pH = pI, avremo una maggior concentrazione di Zwitterione, che si stacca dalla resina. Ne consegue che gli amminoacidi che tenderanno ad uscire prima, saranno quelli con pI più basso (quindi, quelli con ulteriori catene acide, tipo l’acido aspartico o il glutammico).

Quelli che tenderanno ad uscire più tardi sono gli amminoacidi con punto isoelettrico più elevato, come per esempio la lisina, l’istidina e l’arginina. In realtà, la questione non è così semplice e lineare, non tutto dipende dal punto isoelettrico. Ad esempio, vediamo come la treonina e la serina siano tra i primi amminoacidi a uscire. Esse possiedono infatti una struttura abbastanza polare.

Ma cosa c’entra questo particolare con quanto detto fin ora? Dobbiamo specificare che la cromatografia a scambio ionico funziona anche, in parte, come una cromatografia a fase inversa, laddove la fase stazionaria (la resina) presenta struttura apolare. Questa quindi lega più facilmente le sostanze maggiormente apolari, lasciando uscire prima quelle polari.