Appunti biomateriali Chiesa AA 2015/2016

B. TRATTAMENTI BIOMIMETICI SUL TITANIO

Già il titanio di per sé, rispetto agli altri metalli, ha buone proprietà di osteointegrazione (al

massimo dev’essere irruvidito in ortopedia per favorire un’interconnessione meccanica – non

c’è un legame chimico tra osso e impianto!). Questo aspetto può essere ulteriormente

migliorato, in particolare aumentando la velocità di fissazione mantenendone la stabilità. La

velocità è specialmente importante in odontoiatria: devono trascorrere 3-4 mesi prima di poter

costruire l’osso artificiale sopra l’impianto, è utile ridurre al minimo questo tempo di attesa.

Il titanio non ostacola l’osteointegrazione, anche se la superficie non è riconosciuta dagli

osteoblasti come superficie da colonizzare. Il processo è lento, favorendo la possibile

formazione di tessuto fibroso.

In presenza di HA, gli osteoblasti riconoscono tale superficie come da colonizzare favorendo una

rapida osteointegrazione primaria; il deposito di HA tende però a essere riassorbito,

frammentandosi e formando detriti. Impianti dentali rivestiti in HA hanno mostrato un

comportamento inferiore rispetto agli impianti puramente in titanio.

HA viene infatti utilizzata normalmente nelle protesi non cementate in ortopedia, ma non in

odontoiatria: le sperimentazioni hanno rivelato dei problemi insiti nella diversa modalità di

carico e geometria dell’impianto dentale rispetto ad una protesi ortopedica. La protesi d’anca

s’insedia in un cuneo e trasmette forze di taglio/compressione tra impianto e osseo; l’impianto

dentale è a forma di vite autofilettante, trova la sua sede inserendosi direttamente. Gli sforzi di

taglio sulla superficie sono in questo secondo caso maggiori; ciò portava a

delaminazione/distacco del film di HA (specialmente no rivestimenti catodici che sono ancora

meno adesi, ma neanche plasma spray).

Una possibile soluzione è modificare la superficie del titanio con un trattamento biomimetico

per favorire l’apposizione di nuovo osso. TiO2 superficiale è un film di pochi nm, impermeabile

all’ossigeno (protettivo) e molto stabile: si ricostituisce velocemente se viene rimosso. Può

essere modificato con diverse tecniche che mirano a favorire la precipitazione di calcio-fosfati

direttamente dai fluidi biologici, evitando che la superficie venga passivata/schermata da

specifiche proteine. In questo modo si evita lo strato sottile di HA che potrebbe staccarsi o dare

luogo a detriti. 50

L’idea è quella di modificare la composizione dell’ossido TiO2 in modo da creare condizioni

chimiche che facilitino la precipitazione immediata di ioni calcio e fosforo, prima che la

superficie venga schermata dalle proteine. Inoltre si vuole favorire contemporaneamente

l’adesione protesica selettiva e l’adesione, la proliferazione e il differenziamento di osteoblasti.

B.1 TRATTAMENTO CHIMICO: METODO KOKUBO

Metodo Kokubo: nato da un ricercatore giapponese che mette a punto un trattamento chimico

per la modifica.

Immergendo il titanio in una soluzione di idrossido di sodio, a una certa concentrazione e

T>Tamb per velocizzare il processo (NaOH 5M a 60/80°C per 24h), sull’ossido si creano dei

gruppi ossidrili TiOH. Successivamente viene sottoposto a un trattamento termico a 600°C per

un’ora (quasi al limite dei problemi di ossidazione del materiale), in modo da stabilizzare il fluido.

Sperimenta direttamente in vivo o con immersione in simulating body fluid (soluzione con sali

simili ai fluidi biologici ma senza proteine); si forma un idrogel di titanato sodico, dove il sodio

viene progressivamente sostituito dal calcio. Infine, inizia la precipitazione di calcio e fosforo a

formare uno strato di apatite.

Fa poi una valutazione meccanica e istologica sugli esperimenti in vivo eseguiti; in SBF, già dopo

3 giorni, si vedeva l’apposizione di uno strato apatite. In vivo, dopo 4 settimane, la forza di push

out (campioncini cilindrici di cui viene studiata la forza di legame, cioè viene quantificato lo

sforzo per estrarli dall’impianto) è maggiore nel campione trattato rispetto al titanio normale.

Dopo 12 settimane invece, il valore è circa lo stesso.

Anche l’osso apposto è molto maggiore per le 4 settimane, mentre i valori si equivalgono dopo

tre mesi; la crescita ossea avviene sul titanio modificato senza crescita fibrosa, al contrario di

quello normale.

Dopo 12 settimane non cambia molto, ma nel breve termine sì: il titanio modificato dà risultati

migliori, nel senso che reagisce più velocemente. L’obiettivo è velocizzare la guarigione e non

migliorare l’osteointegrazione del titanio!

Il vantaggio del medio-lungo termine è il contatto diretto osso-titanio, senza rischio di

formazione di tessuto fibroso.

B.2 TRATTAMENTI ELETTROCHIMICI

Negli anni successivi vengono impiegati anche trattamenti elettrochimici, più veloci ed efficaci

(Anodic Spark Deposition o Plasma Electrolytic Oxidation). Essi prevedono:

 film nanoporosi ottenuti in acido solforico e fosforico

 trattamenti bioattivi tipo TiSpark 51

B.2.1 FILM NANOPOROSI, ACIDO SOLFORICO E FOSFORICO

Se lo collego come anodo, posso causare un’ossidazione per via esterna applicando un

potenziale (impongo passaggio di corrente e governo il processo di ossidazione dall’esterno).

Polarizzo elettrochimicamente il titanio con tensioni molto elevate (200-300V); lo spessore del

film andrà ad aumentare da circa 2nm a circa 800nm.

Siccome il film è isolante, si verificano delle microscariche elettriche che rompono il film: si ha

microfusione locale perché le correnti si concentrano in questi punti dove il dielettrico si è rotto;

l’alta temperatura causa la generazione di plasma (durante la risolidificazione, all’interno del

film possono essere inglobate le specie chimiche in soluzione). Si creano dei veri e propri

microcrateri (circa 5-10 micron per il singolo poro) .

Alcune aziende proponevano pori più ampi e evidenti nella zona più bassa

dell’impianto, a contatto con l’osso spongioso, mentre pori meno evidenti verso

l’osso corticale (colletto).

Impianti dentali osteointegrati con superficie nanoporosa ottenuta utilizzando

la tecnica ADS in acido solforico (successivamente in fosforico) sono già da

tempo usati clinicamente.

B2.2 TRATTAMENTO SPERIMENTALE BIOATTIVO “TISPARK”

Si voleva modificare la morfologia superficiale dell’ossido (da pochi nm a 100 nm), ma anche

modificarne la composizione chimica, per velocizzare l’apposizione ossea. Inizialmente, circa 10

anni fa, vengono realizzate 2 anodizzazioni, una per arricchire di ioni fosfato e una per ioni calcio

(due soluzioni con parametri diversi); il tutto seguito da un trattamento ad idrossido di sodio,

come in Kokubo. NON segue trattamento termico. La morfologia diventa così nanorugosa.

FASE 1: doppia ASD

Due trattamenti ASD che determinano morfologia nanoporosa e arricchiscono il film con ioni

PO4 3- e, nel secondo trattamento, ioni Ca2+ ; essi consentono di favorire l’ulteriore

precipitazione di queste speci dall’ambiente biologico, determinando mineralizzazione.

FASE 2: Funzionalizzazione

Il film viene funzionalizzato in modo da ottimizzare il rapporto Ca/P e introdurre legami –OH,

in modo da favorire una adesione proteica selettiva e la colonizzazione osteoblastica. 52

Viene modificata la composizione del titanio e del suo film: ho una continuità tra film di ossido

superficiale con calcio-fosfati e substrato metallico. Non è un rivestimento, ma una sostituzione

graduale dall’ossido contenente calcio e fosforo al bulk di titanio. Il film superficiale è

perfettamente aderente, anche dopo una piegatura macroscopica di 20°.

XRD descrive la composizione qualitativa: calcio, titanio, fosforo, ossigeno come elementi del

film.

L’analisi metallografica seziona un campione trasversalmente, dividendo titanio, film e resina in

cui inglobo il campione per l’analisi (il titanio riflette bene la luce quindi riesco a valutare lo

spessore del film). Il film rimane aderente anche se deformo plasticamente l’impianto,

diversamente da quanto accade con HA (dove si cricca e scheggia, perché è un ceramico che

sopporta una limitata deformazione e solo elastica).

Mineralizzazione: immergo in SBF per 14 giorni e vedo che il titanio si riveste di uno strato

compatto di HA di alcuni micrometri: morfologia a bolle = rivestimento di fosfato di calcio. Sul

titanio non trattato non si ha invece nessuna precipitazione.

Proliferazione: In vivo, con cellule di linea eucariote, ad esempio ossee, confronto titanio

normale e titanio TiSpark (trattato): a livello di proliferazione di cellule a 1 giorno e a 3 giorni

sulla superficie, ho risultati decisamente migliori su TiSpark, simile ai valori del controllo

(pozzetto di coltura).

Anche la morfologia di deposizione è diversa: dopo 3 giorni, le cellule seminate sul titanio

normale cominciano ad appiattirsi e a comunicare con filopodi, mostrando ancora un basso

spreading (sull’acciaio sarebbero rimaste invece isolate e tondeggianti, perché si integrano

molto più lentamente); sul modificato, le cellule sono già completamente appiattite e

confluenti, senza presenza di filopodi. L’organizzazione del citoscheletro è ottimale,

confrontabile al controllo.

Per quanto riguarda la sintesi di collagene, cioè di matrice, si vede che il titanio modificato

aumenta di molto la produzione di collagene (valori doppi del titanio normale!). La fosfatasi

alcalina dà invece un’idea della differenziazione e dell’attività cellulare; cresce di molto tra 24 e

72 ore. La proliferazione è già quasi conclusa e le cellule iniziano già a differenziarsi.

Un altro indicatore è il tipo di proteine che troviamo alla superficie: dopo l’immersione, sul

titanio prevale l’albumina (proteina passivante, scherma gli aspetti positivi che vorrei), mentre

,

sul modificato si adsorbe soprattutto fibronectina (indizio positivo stimola l’adesione

cellulare).

In conclusione si può affermare che TiSpark è un procedimento innovativo, piuttosto semplice

e che velocizza la guarigione; è stata poi applicata clinicamente e approvata dall’FDA. Infatti è

stata scelta da un’azienda americana per l’applicazione industriale (più semplice che per

un’azienda europea, ma comunque dopo 10 anni dallo sviluppo!); inoltre il trattamento è sicuro:

calcio, fosforo, sodio sono già presenti nei fluidi biologici. Non ci sono rischi di tossicità o di

stabilità meccanica per l’impianto. 53

Permette di ottenere:

 Un rivestimento aderente e omogeneo su titanio composto prevalentemente da TiO2,<