Analisi degli OGM negli alimenti - Appunti

DNA

Quindi buffer di reazione, magnesio, primer, sonde, nucleotidi, dna polimerasi, e UNG, cosa serve

l’UNG? Per correggere il carry over, per correggere le contaminazioni precedenti, (uracile

guanidinio ciclasi) la ung si usa moltissimo nella quantificazione perché avendo a che fare con

curve di taratura voi maneggiate sempre all’interno della stessa piastra magari il plasmide, dna

estratto da materiale di riferimento il che significa che sono facili le contaminazioni proprio perché

il procedimento di quantificazione di per se prevede che in parallelo al campione incognito facciate

sempre una curva di calibrazione e quando si fanno curve di calibrazione c’è in giro del dna ed è

facile contaminare puntali, pipette guanti etc. nelle reazioni di pcr si co amplifica con il dutp in

modo tale che nel doppio filamento di dna venga incorporato l’uracile al posto della timidina, a

questo punto succede che tutti i prodotti di pcr contengono questo residuo, se tu hai una

contaminazione significa che il + delle volte il tuo prodotto di pcr ti contiene questa schifezza, se tu

prima di fare la pcr tratti con questo enzima che provoca l’eliminazione della base azotata, in

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condizioni alcalina che è tipica della pcr perché il tampone della pcr è intorno a 9/ 8.6 dipende si ha

rottura del doppio filamento già durante il primo step a 95° e questo significa che tutti i prodotti di

contaminazione prima ancora che inizi la pcr perché la pcr comincia la primo ciclo quando ha fatto

il primo step di denaturazione a 2 minuti e poi comincia a fare i cicli che ne so 95 a 30 secondi, 60

gradi a 30 secondi, il tempo di estensione tot secondi a secondo della lunghezza, prima ancora che

inizi il ciclo di amplificazione vera e propria tutto quello che era contaminazione se conteneva

questo residuo viene eliminato, quindi questo è un modo comune per procedere, poi ci sono anche

delle contro indicazioni, soprattutto nelle semi nested: se devo amplificare successivamente, la

seconda pcr non mi deve contenere quel sistema enzimatico altrimenti mi digerisco il templato

questo sembra ovvio però è un errore frequente!! Quindi cosa c’è dentro a una tipica reazione di

pcr, *** faccio vedere una slide e vi dico questa è una reazione di pcr duplex e voglio sapere che

cosa significa in duplex, *** cosa c’è dentro, *** come mai i due primer siano sbilanciati: li

sbilancio perché essendo una co amplificazione gene endogeno e transgene, devono amplificarsi

allo stesso modo e tutte e 2 le pcr dovrebbero avere una efficienza pari al 100%, invece quello del

gene endogeno mi sottrae reagenti all’altra reazione quindi metto meno primer, *** come mai il

profilo termico nella reazione taqman è fatto così:

Profilo termico taqman

50°C x 2min

95°C x 10 min

95°C x 15 sec

60°C x 1m

e così nella reazione scorpion:

Profilo termico

95°C x 2 min

95°C x 0 sec

57°C x 0 sec

72°C x 10 sec

sostanzialmente come cicli uno step di denaturazione uno di estensione e anniling comune, nella

scorpion invece abbiamo 3 step cioè denaturazione anniling separato da quello di estensione, ***

come mai in un profilo termico taqman di norma ho un solo step di denaturazione e uno step di

anniling e estensione che coincidono mentre nella scorpion tre step? Dipende dalle condizione di

ottimizzazione della reazione taqman, normalmente il profilo termico di una reazione taqman ha

solo 2 step, cioè ha 2 temperature una di denaturazione e una di anniling e estensione che

coincidono mentre invece nella scorpion sono separate questo perché la reazione taqman si basa

sull’attività esonucleasica 5’3’ della dna polimerasi, questa attività nel caso dell’ampli taq è

ottimizzata per 60/65° a 72° questa attività esonucleasica è minore quindi se io facessi uno step

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distinto o anniling ed estensione a 72° questa attività esonucleasica a 72° non è così efficiente e mi

scalza la sonda, ma non me la digerisce e significa che reporter e fluoroforo rimarrebbero sempre

comunque vicini e non avrei emissione, (vedi slide linee guida per il disegno di primer e della sonda

c’è scritto che dovrebbero essere intorno a 60°), mentre per la scorpion che non si basa sulla attività

esonucleasica della dna polimerasi il che permette di avere temperatura di estensione a 72° e di

disegnare la temperatura di anniling alla temperatura + comoda per i primer, *** come è fatto un

profilo termico di una reazione taqman? C’è una slide dedicata, il primo step di una reazione

taqman prevede incubazione a 50° prima della step di denaturazione, c’è questo 50° perché è la

temperatura ideale per fare funzionare la UNG, bisogna lasciare il tempo alla UNG di digerire

eventuali contaminanti, poi si fa uno step di denaturazione a 95° per 10 minuti, come mai così a

lungo? Perché l’ampli taq è una taq di tipo hot start, è una taq modificata, una volta nel buffer

veniva messo un anticorpo che legava il sito catalitico dell’enzima (DNA POLIMERASI) per cui

solo il trattamento a 95° causava il distacco dell’anticorpo dal sito catalitico e rendeva la dna

polimerasi attiva, adesso si sono evolute in realtà sono taq polimerasi ingenierizzate in modo tale

che solo i trattamenti a 95° comportano modificazione tridimensionale da esporre il sito catalitico

dell’enzima e renderla funzionale, dopo di che comincia il solito ciclo a 95° per 15 secondi perché

15 secondi sono + che sufficienti per denaturare un doppio filamento, e poi 1 minuto a 60° per il

motivo che abbiamo detto, quindi *** come è fatto una reazione taqman, come mai sono sbilanciati,

come è fatto il profilo termico e perché? Come mai si usa l’hot start?

Abbiamo detto che questo medito di quantificazione è un metodo di quantificazione del delta ct

comparativo perché in questo caso la curva di taratura viene fatta come logaritmo di percentuale di

gmo sul delta ct, intendendo per delta ct il delta ct che c’è fra il gene endogeno e il transgene, quindi

amplifico 100 nano grammi di dna estratto da un calibratore che può essere farina 1%, quindi per

ogni punto di calibrazione avrò una curva di amplificazione del gene endogeno e del transgene, una

base line, una tresciold e un ct per il gene endogeno e un ct per il transgene, il delta ct è quello che

riporto nel grafico per ogni percentuale di gmo, nella slide 15 si vede il delta ct della

quantificazione del materiale certificato a diverse percentuale di gmo per la sonda scorpion, per la

sonda taqman con le reazioni fatte in simplex cioè gene endogeno e gene esogeno separati, retta di

calibratura invece fatta con la reazione taqman duplex: co amplificazione gene endogeno e gene

esogeno, quindi si costruiscono delle curve di calibratura considerando stavolta il delta ct che è la

differenza fra il ct per il gene esogeno e per il transgene per ciascun standard. In queste tabelle slide

16 abbiamo la percentuale di gmo, abbiamo uno standard a 0, 0.1, 1 e 2% di gmo, poi abbiamo un

segnale dato dal gene endogeno, poi un segnale dato dal transgene, per ciascun punto, quindi

abbiamo estratto da un campione di farina gmo 0% del dna e ne abbiamo amplificato 100 nano

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grammi e ne abbiamo fatto tre repliche di amplificazione e questi per il gene endogeno sono i ct

rilevati, il segnale emerge dalla base line che incrocia la tresciold, nella prima replica 22.66, 22.55,

22.89 poi c’è la media e la deviazione standard e via così per i vari punti di calibrazione e per quelli

dello standard, poi ci sono quelli per la sonda scorpion, quelli per la reazione di amplificazione

taqman in simplex e per quella in duplex, *** come mai vedete che all’aumentare delle

concentrazione di gmo il gene endogeno emerge sempre + o – allo stesso ct? Perché ho sempre lo

stesso numero di copie, sarà diverso il contributo dato dal dna transgenico da quello wild tipe di

conseguenza il ct rimane sempre + o - =. Mentre quello che deve variare proporzionalmente è il ct

che ottengo quando estraggo 100 nano grammi di dna, lo amplifico, nel caso dello standard al 0%

contenuto di gmo, 0.1, 1 e 2% e come vedete i ct tendono a calare nel caso del gmo, 0% è zero

perché non ce ne sono, poi vedete che man mano aumenta il contenuto di gmo tende ad abbassarsi il

ct, come mai? Il ct è il ciclo soglia, all’aumentare dei cicli aumenta il numero di amplificati e

aumento il segnale in fluorescenza, se io fisso un livello di fluorescenza appena sopra al livello di

fondo quando la curva di amplificazione mi incrocia la soglia io sono in grado di ricavare il ct che è

il ciclo al quale il segnale di amplificazione emerge dal rumore di fondo, il che significa che + copie

ci sono + il ct è basso perché prima questa curva spunterà dal rumore di fondo, allora ritornando alla

tabella se sto guardando il segnale emesso dal transgene all’aumentare del contenuto di gmo mi si

abbassa il ct, se io estraggo 100 nano grammi di dna da questo calibratore qui e li amplifico avrà lo

0.1% di dna transgenico, avrò un certo numero di copie e mi emerge a 34.62, se estraggo sempre

100 nano grammi di dna da questo calibratore che mi contiene il 2% di soia transgenica avrà un

numero di copie maggiore quindi il ct si abbassa, quindi significa che il mio sistema funziona

relativamente bene. Abbiamo detto che l’intensità del segnale di fondo mi viene dato dai bianchi,

per essere precisi è il segnale dei bianchi + 3 volte da deviazione standard, noi abbiamo il segnale

dei bianchi che è un fascio e avrà una diversa intensità, la macchina calcola il valore medio di

fluorescenza di questi bianchi e calcola la deviazione standard, la soglia, la tresciold che è possibile

fissarla anche a mano, viene fissata come valore medio + tre volte da SD, i bianchi sono i controlli i

campioni in cui ometti il dna, nel caso delle sonde taqman è dato dalla degradazione di per se della

sonda, la sonda risulta essere attiva quando il reporter si separa dal quencer, normalmente questo

avviene per attività esonucleasica, ma durante i cicli di pcr queste sonde subiscono degli stress

termici quindi tendono a idrolizzarsi, a rompersi quindi reporter e quencer si separano e un minimo

di emissione c’è comunque e questo costituisce il rumore di fondo. Un’altra causa di rumore di

fondo potrebbe essere contaminazione da dna se non si usa l’UNG, se abbiamo contaminato i dntpis

o i buffer di reazione, classicamente le prime volte in cui si lavora con la real time ci si accorge di

quanti bianche sono dei falsi negativi, quando li si fa per pcr su gel d’agarosio la sensibilità della

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colorazione