8 - Drug Design

Lead

Questa fase consiste nella ricerca del miglior ligando, cioè del ligando che ha maggiore affinità, soprattutto da un punto di vista strutturale, per il bersaglio (target). Questi ligandi prendono il nome di lead compound (o composti guida) e saranno la "materia grezza" su cui i ricercatori lavoreranno per sviluppare un farmaco in grado di legarsi bene al bersaglio terapeutico. Generalmente, un composto lead, rispetto al farmaco da questo generato, presenta una minor complessità strutturale, peso molecolare inferiore, minor numero di legami ruotabili, inferiore idrofobia. Durante questa fase vengono testate più molecole per cercare quella con migliore efficacia, con migliore capacità di legare il bersaglio. Sebbene le tecniche di progettazione per la previsione dell'affinità di legame abbiano ragionevolmente successo, ci sono molte altre proprietà, come la biodisponibilità, l'emivita metabolica, gli effetti.

collaterali, ecc., che devono essere ottimizzate prima che un ligando possa diventare un farmaco sicuro ed efficace. Queste caratteristiche sono spesso difficili da prevedere. Per questo, una maggiore attenzione viene focalizzata all'inizio del processo di progettazione sulla selezione di farmaci candidati le cui proprietà fisico-chimiche sono previste per provocare un minor numero di complicazioni durante lo sviluppo e quindi maggiori probabilità di portare a un farmaco approvato e commercializzato.

Inoltre, esperimenti in vitro integrati con metodi di calcolo sono sempre più utilizzati nella scoperta precoce di farmaci per selezionare composti con ADME (assorbimento, distribuzione, metabolismo ed escrezione) più favorevole e regolamenti migliori profili tossicologici. I ligandi candidati devono anche rispettare la regola del 5 (o Lipinski's Rule of Five, LRS), cioè i ligandi devono avere:

• peso molecolare minore o uguale a 500 g/mol;
• numero di legami come

accettori minore o ugle a 10;

numero di legami H come donatori minore o uguale a 5.

Tutti i numeri sono multipli di cinque e per questo si parla di regola del 5.

Fino a qualche anno fa piuttosto che trovare nuove molecole più potenti e che magari avessero altri bersagli terapeutici, si ricorreva a modificare, con l'aggiunta di particolari gruppi funzionali, il farmaco già esistente. Per migliorare la fase di ricerca del lead compound migliore sono state introdotte delle tecniche che permettono di ottenere un formato 3D del bersaglio (vedi prima) e quindi ricreare virtualmente l'interazione tra i lead compound candidati e il bersaglio di interesse. Il metodo che ricrea virtualmente l'interazione tra ligandi candidati e bersaglio prende il nome di Virtual High Throughput Screening (o docking molecolare). La filosofia del virtual screening si basa sul test di affinità tra ligando e recettore, i quali ligandi provengono da banche dati possedute da varie ditte farmaceutiche,

nelle quali banche dati possono essere presenti ligandi sintetizzati chimicamente, ligandi naturali ecc. Cosa è un ligando naturale? Per ligando naturale si intende, ad esempio, il substrato fisiologico di un determinato enzima. Se si conosce la struttura del substrato, si conosce anche la reazione di degradazione del substrato: quando un enzima si lega al substrato lo degrada, però prima si ha uno stato di transizione in cui il substrato lega con la massima interazione il sito attivo dell'enzima. Per sviluppare un farmaco che deve svolgere, ad esempio, un'azione di inibizione sull'enzima bisogna conoscere la struttura composta da substrato che interagisce con l'enzima; se si conosce questa struttura si può sintetizzare una molecola con struttura simile a quella del substrato, ma questa molecola deve essere progettata in modo da non degradarsi e rimanere, quindi, legata al sito attivo dell'enzima. Questo è un processo di inibizione cheè alla base di alcune patologie. Prima di procedere al vero virtual screening bisogna effettuare una fase, chiamata PREPARED DATABASE. Significa che le strutture presenti nel database molto spesso sono rappresentate in formato 2D: allora io le devo trasformare in molecole con le cariche già calcolate. Preparato anche il target, passo al vero docking. Quindi, nel virtual screening ogni ligando interagisce virtualmente con il recettore ed il computer determina un punteggio di questa interazione tenendo conto di parametri geometrici ed elettrostatici. Il docking molecolare si può pensare come un problema "serratura e chiave", di dove bisogna capire il corretto orientamento "chiave" "serratura" della che aprirà la (in quale superficie della serratura c'è il buco, in quale direzione bisogna girare la chiave dopo che è inserita, ecc.). La proteina può essere immaginata come la "serratura" e il ligando

Come "chiave". Lo scopo del docking molecolare è quindi quello di ottenere una conformazione ottimizzata sia per la proteina e il ligando e il loro orientamento relativo tale che l'energia libera del sistema sia minimizzata (cioè in modo da far raggiungere uno stato di equilibrio al sistema). Questa metodica è praticamente a costo 0, mentre a livello sperimentale avrebbe un costo assai elevato. Tuttavia, non è sempre possibile fare questi esperimenti sia a livello teorico (computazionale) che pratico. Trovate le molecole (lead compound) che meglio si associano al target (hanno una maggiore affinità per il bersaglio), si testa la loro efficienza in vitro.

DOCKIl primo programma di docking che fu sviluppato prende il nome di DOCK. Questo programma ha subìto un'evoluzione nel corso degli anni. Inizialmente esso considerava la molecola del target e la molecola del recettore come un insieme di atomi che venivano assimilati a delle sfere.

Però di queste sfere venivano escluse tutte quelle che non erano tangenti alla superficie di van der waals. Quindi sia il target che il ligando erano un insieme di sfere tangenti alla superficie di van der waals. Quindi, le molecole così semplificate venivano tra loro sovrapposte e si cercavano i siti del target compatibili con i siti del ligando. In questo modo si escludevano tutti quei siti del target non compatibili con il ligando. Una volta semplificata ulteriormente la molecola del target, si otteneva una struttura che andava minimizzata e manipolata al fine di trovare la giusta posa di interazione, cioè la giusta disposizione delle sfere del target in modo tale che questa molecola si incastrasse bene con quella del ligando. In questo modo, però, si considerava esclusivamente la complementarietà sterica, ma non si considerava la complementarietà del potenziale e cioè non si considerava il fatto se target e ligando fossero polari o no.apolare o non si considerava, nel caso entrambe le molecole fossero state entrambe polari, la carica che esse possedevano. Per trovare la giusta posa di interazione si facevano delle prove: si consideravano tre coppie di sfere (ciascuna coppia considerava una sfera del ligano e una del target) e per ciascuna coppia di sfera si calcolava uno score che veniva così espresso: Maggiore era il valore di questo score e maggiore era la complementarietà tra quella regione del target e la corrispondente regione del ligando. Poi si andava avanti confrontando le stesse tre sfere (atomi) del target con altre tre sfere del ligando e si calcolava il punteggio e così via. Tuttavia questo metodo risultava molto impreciso, era molto lento, considerava la sola complementarietà sterica; un altro limite di questo metodo e non meno importante degli altri è che assumeva il modello Rigid Protein Docking, cioè considerava sia il ligando che il target fissi in una

determinataconformazione.Un primo cambiamento relativo a questo programma riguardava proprio la funzione (laformula) dello score. Cioè successivamente lo score non venne più calcolato con laprecedente formula ma con la formula riportata di seguito:

C è un punteggio relativo alla complementarietà sterica;

sE = energia potenziale associata alle interazioni di non legame (si utilizza iln-Amberpotenziale di Lennard Jones)

E = energia potenziale associata alle interazioni elettrostatiche.coulomb

Il dock in definitiva effettua un’analisi conformazionale sistematica, quindi perincrementi degli angoli torsionali. Sebbene la concezione di assimilare le molecolecome delle sfere ha permesso di avere una grossa velocità nel calcolo, questo non èattualmente il miglior programma di docking soprattutto perché la flessiblità delligando è considerata solo in modo parziale. AUTODOCK

Un altro programma di docking prende il nome di e

Questo programma è nato per poter prevedere l'interazione tra proteina e ligando. A differenza del precedente programma, in questo il ligando è considerato flessibile e le conformazioni del ligando vengono generate per mezzo del metodo Monte Carlo. L'energia di interazione viene valutata mediante il campo di forza AMBER. I movimenti rototraslazionali e rotazionali degli angoli torsionali del ligando sono effettuati contemporaneamente al docking, mediante una metodologia chiamata simulated annealing (Boltzmann Jump). Inoltre, grazie all'eliminazione dei minimi locali sulla superficie, che potrebbero interferire con il risultato, viene selezionato solo il minimo assoluto. Quindi questo algoritmo è una metodica all'interno di un'altra metodica di analisi conformazionale. Vediamo cosa significa che questo algoritmo "elimina i minimi locali sulla superficie". Immaginiamo che il ligando possa interagire con punti

compreso tra 0 e 1 e se N>F, il nuovo ori