7 - Predizione di strutture, analisi conformazionale e dinamica molecolare

Protein structure prediction

La conoscenza strutturale delle macromolecole biologiche, come le proteine, è cruciale per una comprensione piena delle loro funzioni oltre che per numerose applicazioni pratiche, come l'ingegneria delle proteine ed il drug design. La cristallografia a raggi X e la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) sono le due tecniche principali usate per ottenere queste informazioni. Quando, però, non è possibile fare ricorso a una di queste tecniche, la struttura 3D di una proteina può essere predetta e si parla, appunto, di protein structure prediction. Di seguito si descrivono i vari metodi che permettono di ottenere la struttura di una proteina.

Diffrazione a raggi X

Lo schema sperimentale di questa tecnica prevede che un fascio di raggi X colpisce un cristallo, il quale devia questi raggi in più direzioni (fenomeno detto diffrazione o scattering) e questi raggi deviati vengono registrati ed elaborati fino a formare uno spettro di diffrazione. La sorgente di raggi X è tenuta fissa mentre campione e detector ruotano (schema Bragg-Mentano).

Questo schema potrebbe sembrare molto simile a quello di un microscopio. Tuttavia, in quest'ultimo caso il fascio di luce (e non di raggi X) viene focalizzato da una lente per ricreare l'immagine ingrandita. Nel caso della diffrazione non esistono lenti che permettono di focalizzare raggi X. Pertanto lo spettro di diffrazione viene elaborato attraverso l'impiego di software fino ad ottenere una mappa delle densità elettroniche, ovvero una mappa che indica dove sono posizionati i vari elettroni. Bisogna precisare che con la diffrazione non si vedono gli idrogeni perché la loro densità elettronica è molto bassa.

L'oggetto che viene colpito dal fascio di raggi X e che determina il fenomeno della diffrazione è un cristallo. Per definizione un cristallo è un sistema periodico, composto, cioè, da atomi equidistanti e paralleli. La distanza tra un atomo ed un altro dello stesso cristallo è dell'ordine di 1 Å, similmente alla lunghezza d'onda dei raggi X. Quindi, in un cristallo ci sono tante piccole fenditure che hanno dimensioni paragonabili a quelle dei raggi X. Per questo motivo quando un raggio X attraversa una fenditura del cristallo, esso viene diffratto in tante direzioni.

I solidi cristallini sono caratterizzati da una geometria ripetitiva che si estende nello spazio tridimensionale. Esiste un motivo nel cristallo che si ripete indefinitivamente per traslazione semplice nelle tre dimensioni. Si può individuare nel motivo che si ripete, costituito da ioni e atomi, una porzione di spazio che contiene tale motivo: questa è la cella elementare del cristallo (cioè la porzione di spazio con il più piccolo volume che contiene il motivo strutturale che si ripete). Il cristallo deve avere dimensioni tali da poter essere colpito dal fascio di raggi X, quindi deve essere più grande del fascio stesso. Dall'ultima fase di questa tecnica, come detto, si ricava una mappa delle densità elettroniche. In base a questa mappa bisogna capire come posizionare gli aminoacidi. La mappa di densità elettronica deve essere immaginata come se fosse il guscio della proteina. L'operatore prende la sua sequenza, la inserisce nel guscio in modo da riempire perfettamente il guscio. Si ottiene, così, la struttura.

Risonanza magnetica nucleare (NMR)

La risonanza magnetica nucleare è un'altra tecnica sperimentale che permette di determinare la struttura tridimensionale di una macromolecola (ad esempio, una proteina). Questa tecnica permette di ottenere informazioni dettagliate sulla struttura delle molecole osservando il comportamento dei nuclei atomici in un campo magnetico. Prima di spiegare in cosa consiste, è bene stabilire i concetti di numero quantico di spin e di momento angolare.

Qualunque oggetto rotante intorno ad un asse ha un momento angolare, che è una grandezza vettoriale. La direzione e il verso di questo vettore possono essere determinati attraverso la regola della mano destra. Supponiamo che il corpo ruoti verso sinistra: facendo ruotare la mano destra verso sinistra, il pollice (che indica il momento angolare) è rivolto verso l'alto; facendo ruotare la mano destra verso destra, il pollice è rivolto verso il basso. Quindi in base a come ruota la mano destra possiamo definire la direzione e il verso del momento angolare.

Anche gli elettroni hanno la capacità di ruotare intorno al proprio asse e quindi anche essi hanno il proprio momento angolare, detto momento angolare di spin dell'elettrone o semplicemente spin dell'elettrone.

Ogni atomo è formato da un nucleo centrale composto da protoni (aventi carica positiva) e neutroni. Gli elettroni girano intorno al nucleo. Se il numero di protoni è pari e anche il numero di neutroni è pari, il nucleo di un determinato atomo sarà privo di movimento. Ma se il numero di protoni e/o il numero di neutroni è dispari, quindi se numero di protoni e neutroni è diverso il nucleo avrà un movimento e tale nucleo si comporta come se ruotasse. Possiede, pertanto un momento angolare di spin P. Questo momento angolare dipende dal numero quantico di spin I che, in questo caso, può essere 0 (il nucleo non ha movimento), 1/2 , 1 e così via fino a 6. P e I sono fissi per ogni nucleo e non variano. Quello che può variare è l'orientazione di P (essendo un vettore). Anche l'orientazione è quantizzata ed il vettore P può assumere solo 2I+1 orientazioni. Ad esempio, un nucleo con I=1/2 avrà (1/2)+1= 2 orientazioni definite dal numero quantico m=-I; -I+1...+I-1; +I. Anche se è possibile effettuare esperimenti NMR su nuclei con I>1/2, solitamente le tecniche NMR riguardano i nuclei con I=1/2. Per i nuclei con I=1/2 le conformazioni possibili del momento angolare sono solo due (u è il momento magnetico che ha la stessa direzione del momento angolare):

• La prima conformazione è detta alfa; quella di destra è detta beta. I due stati hanno la stessa energia.

Per studiare la struttura delle proteine, queste vengono marcate con atomi di cui si conosce già il movimento del nucleo e le due conformazioni del momento angolare (due conformazioni perché si considerano solo atomi con nucleo con I=1/2). Dopo aver marcato le proteine con questi atomi, si sottopone il campione, e quindi anche i nuclei, ad un campo magnetico B. Nel momento in cui questi nuclei vengono sottoposti ad un campo magnetico, si crea una differenza di energia tra i due stati conformazionali alfa e beta. Quello alfa si troverà a una energia minore rispetto a quello beta. Poi si procede aggiungendo un altro campo magnetico oscillante e perpendicolare al primo e se i fotoni di questo campo magnetico possiedono una energia esattamente identica alla differenza di energia tra lo stato alfa e beta, essi verranno assorbiti mentre i nuclei cominceranno ad oscillare. Non appena il campo magnetico viene cessato, i nuclei torneranno al loro stato energetico originale emettendo le radiazioni che avevano assorbito. Dall'insieme delle radiazioni emesse da un campione è possibile ricostruire uno spettro NMR che rappresenta una sorta di impronta digitale dei gruppi chimici in esso presenti. L'informazione davvero importante di questi spettri risiede nei picchi al di fuori della diagonale principale.

Ovviamente i nuclei di uno stesso atomo tenderanno a comportarsi nello stesso modo, ma in questo caso sono circondati da altri atomi differenti e il loro comportamento è dipendente proprio da questo intorno chimico. Quindi i nuclei saranno schermati dagli elettroni degli atomi vicini. Quanto più grande è la nube elettronica che li circonda tanto più grande sarà la schermatura. Tutti questi eventi verranno registrati da un detector che fornisce un grafico che riporta i vari picchi di assorbimento in base ai quali è possibile capire quali molecole circondavano un determinato nucleo ed è possibile, quindi, ricostruire la struttura della proteina.

Protein structure prediction: types

Come detto prima, se non si può fare ricorso a nessuna delle due tecniche finora descritte, si può predire la struttura di una proteina. Esistono due tipi di protein structure prediction:

• Comparative, se si usa come modello la struttura di una proteina (o più proteine) già note. A questa classe appartiene il cosiddetto homology modelling, ma anche il protein threading. Queste tecniche (soprattutto la prima) possono generare dei modelli molto affidabili.
• Ab initio (o de novo), se non ci si basa direttamente sulla struttura di una proteina nota, ma si parte da principi fisici. Allo stato attuale, questi metodi non sono ancora molto affidabili, ma sono gli unici usabili se non è possibile trovare un modello (per esempio perché la proteina sotto indagine non si ripiega in maniera analoga a nessuna proteina nota).

Homology modeling

L'Homology modeling è una tecnica di ricostruzione della struttura terziaria di una proteina della quale si conosce la sola sequenza. Questa tecnica si basa sul concetto di omologia: due proteine si dicono omologhe se derivano da un antenato comune ma nel corso degli anni hanno subito mutazioni che hanno permesso di far variare la sequenza (quindi presentano sequenza simile ma non identica e a causa della diversa composizione in AA hanno anche diverso peso molecolare); presentano, inoltre, simile struttura tridimensionale (il più delle volte può succedere che la struttura è conservata mentre la sequenza ha subito un elevato numero di mutazioni tale da far cambiare totalmente la sequenza sebbene la struttura rimane invariata) e proprio perché presentano la stessa struttura avranno la stessa funzione (è la struttura 3D di una proteina, anche se non è l'unico fattore, a determinarne la funzione).

Il modellamento per omologia si articola in vari stadi:

• Identificazione della proteina di struttura nota che si userà come riferimento (template);
• Identificazione delle regioni che ci si aspetta siano strutturalmente conservate (SCRs) tra il template e la proteina target e identificazione delle regioni che ci si aspetta siano variate da un punto di vista strutturale (SVRs). Solitamente le SVR corrispondo alle regioni di giunzione da strutture secondarie della proteina;
• Allineamento delle regioni SCRs della sequenza in esame con le regioni SCRs delle sequenze aminoacidiche del database;
• Costruzione del modello delle regioni conservate usando come coordinate quelle della catena principale della proteina template secondo la corrispondenza dettata dall'allineamento delle sequenze. Non si può, invece, copiare la struttura delle regioni SVR;
• Costruzione del modello delle regioni strutturalmente variabili: regioni in cui ci sono delezioni ed inserzioni; (quindi si fa il loop modeling)
• Modellamento delle catene laterali del modello;
• Rifinitura del modello.

Fase 1: allineamento di sequenza

Questo metodo si basa sull'allineamento di sequenza tra la sequenza di cui si vuole costruire la struttura 3D e le sequenze di un database di proteine di cui si conosce già la struttura 3D. Si considera come sequenza stampo quella che ha la percentuale di identità maggiore con la sequenza in esame. Questo metodo si basa sempre sull'osservazione di proteine note ma non permette di capire come fa una proteina a raggiungere la sua struttura nativa.

Il modellamento per omologia è il metodo più affidabile per ottenere una predizione della struttura tridimensionale di una proteina ed è applicabile quando la percentuale di identità di sequenza tra la proteina da modellare e quella di riferimento è maggiore del 30%, il che implica che le due sequenze sono omologhe. Bisogna, comunque, tener conto anche della lunghezza delle due sequenze, perché se la sequenza è corta e la percentuale di identità è maggiore del 30% ma non è altissima non è detto che le due sequenze siano veramente omologhe. Quindi le catene più corte, per essere omologhe devono avere una percentuale di identità che sia abbastanza elevata.

Attenzione: quando si parla di catene corte non si fa riferimento alla lunghezza totale di una sequenza, ma si fa riferimento al numero di aminoacidi allineati tra loro. Ad esempio, due catene aminoacidiche lunghe ciascuna 600 aminoacidi vengono allineate tra loro e in particolare vengono allineati per una regione di 50 a.a.; di questa regione solo 10 a.a. sono identici. Sicuramente le due proteine non sono omologhe anche se la percentuale di identità risulterà pari all'incirca al 40%. Non sono omologhe perché la curva di Threshold regione allineata è troppo piccola (50 a.a.).

La descrive l'andamento della percentuale di identità in base alla lunghezza della sequenza AA: Se la percentuale di identità tra la sequenza di cui voglio conoscere la struttura 3D e la sequenza AA di cui già conosco la struttura 3D è compresa tra 0 e 30% si parla di zona d'ombra e la proteina di cui si conosce la struttura 3D può essere usata per prevedere il fold complessivo della proteina in esame; se la percentuale di identità tra zona intermediale due proteine è compreso tra il 30 e 60% si parla di e la proteina di cui si conosce la struttura 3D può essere considerata un buon modello e può essere utilizzata per studiare gli effetti dovuti alla sostituzione di particolari residui, posso fare studi di mutagenesi, di elettrostatica generale ecc.; se la percentuale di identità tra le due proteine è compresa tra il 60 e il 100% posso ottenere un modello la cui accuratezza è confrontabile con una cristallografia a raggi X di buona risoluzione.

In generale, se le due sequenze allineate sono omologhe, allora anche il folding dell'una e dell'altra proteina sarà simile. Alcune volte le proteine hanno solo dei domini omologhi a domini di un'altra proteina, quindi potremmo costruire la struttura di piccoli pezzi di quella determinata proteina. Se l'homology modeling viene utilizzato nell'ambito del drug design, è necessario utilizzare strutture che presentano almeno il 70% di identità; inoltre bisognerà spendere molto tempo nella rifinitura del modello. Solo questa tecnica di ricostruzione della struttura 3D potrebbe richiedere fino a 6 mesi di tempo, se non di più. Si può, inoltre, sottolineare che esiste una relazione non biunivoca tra la similarità di due sequenze proteiche e la somiglianza tra le rispettive strutture tridimensionali: infatti, sono anche note proteine che, pur non avendo sequenze simili, hanno strutture simili.

Piuttosto che parlare di Homology modeling, potremmo chiamare questa tecnica con il nome di comparative protein modeling. Questo dipende dal fatto che attualmente non è necessario trovare una sequenza di una proteina omologa alla mia per avere la risoluzione del modello: basta trovare una qualunque proteina con template tridimensionale che abbia una percentuale di identità maggiore del 40%. Non mi importa se una ha una funzione e una un'altra. Si è scoperto che è proprio l'identità di sequenza che determina la sequenza 3D, e non il fatto che siano omologhe.

Per definire la struttura di una proteina che ha una bassa % di identità di sequenza con il template, possiamo utilizzare più template (all'incirca 3 o 4). Ovviamente devo utilizzare degli algoritmi che mi creino un modello valido. La proteina conosciuta e che viene utilizzata come modello per ricostruire il folding della proteina la cui struttura terziaria è sconosciuta prende il nome di template; mentre la proteina della quale si vuole prevedere il folding prende il nome di target.

Fase 5: loop modeling

Anche se i loop non si...