Riassunto esame Biologia, Prof. Ventura Santoro Claudio, libro consigliato Biologia molecolare della cellula, Alberts

Alberts - Biologia molecolare della cellula

Proteine

Le proteine sono fondamentali per il funzionamento cellulare in quanto costituiscono enzimi, canali e pompe per il passaggio di molecole attraverso le membrane cellulari, ma anche anticorpi, tossine, ormoni, ecc…

Le proteine, o polipeptidi, sono costituite da una catena di amminoacidi (ne esistono di 20 tipi) legati da legami covalenti peptidici. Ogni amminoacido ha una catena laterale che lo rende acido, basico, polare senza carica o non polare. Le catene laterali polari tendono a raggrupparsi all'esterno della proteina per interagire con l'acqua, mentre le catene laterali non polari stanno verso l'interno formando un nucleo idrofobico.

All'interno della proteina si formano altri legami non covalenti, quindi più deboli (legami idrogeno, attrazioni elettrostatiche e attrazioni di van der Waals), per dare una struttura ripiegata alla molecola in modo che abbia il minor grado di energia libera, ma questa può cambiare se la proteina interagisce con altre molecole.

Struttura delle proteine

• Struttura primaria: sequenza degli amminoacidi.
• Struttura secondaria: ripiegamenti ad α-elica (più elastica) e β-foglietto (più rigido) grazie a legami non tra le catene laterali, ma tra i gruppi amminici e carbossilici.
• Struttura terziaria: struttura tridimensionale.
• Struttura quaternaria: unione di più proteine dette subunità proteiche (non tutte le proteine possiedono struttura quaternaria).

Infine, una proteina è costituita da diversi domini proteici con diverse funzioni.

Sequenziamento del genoma umano

Sequenziando il genoma umano (PGU, progetto genoma umano completato nel 2003) si è scoperto che possediamo circa 21.000 geni codificanti proteine, ma possiamo produrre più di 21.000 proteine diverse grazie allo splicing alternativo. Molte proteine, soprattutto enzimi, hanno una struttura ripiegata a forma di palla irregolare (proteine globulari), come l'emoglobina presente nei globuli rossi che contiene due α-globina e due β-globina, ciascuna contenente una molecola di eme, il sito a cui si lega l'ossigeno. Altre proteine, principalmente i componenti della matrice extracellulare, sono più stabili e sono dette proteine fibrose.

Funzione delle proteine

Tutte le proteine svolgono una funzione legandosi a molecole particolari, per esempio gli anticorpi, o immunoglobuline, sono proteine prodotte dal sistema immunitario in risposta a molecole estranee. Ognuno si lega a una molecola bersaglio (antigene) inattivandolo o marcandolo per la distruzione. Gli anticorpi hanno una forma a Y con due siti di legame complementari a porzioni della superficie dell'antigene, detti epitopi.

Gli enzimi sono catalizzatori biologici perché accelerano le reazioni senza subire modificazioni, legandosi a substrati e convertendoli in prodotti. L'accelerazione della reazione è dovuta a un abbassamento dell'energia di attivazione della reazione catalizzata.

DNA, cromosomi e genoma

L'informazione ereditaria di un individuo è conservata nelle sue cellule sotto forma di geni e viene trasmessa attraverso la divisione cellulare e la riproduzione. Un gene è una sequenza di nucleotidi per la produzione di una proteina o di un RNA utile alla cellula ed in particolare è una porzione di DNA a cui è attribuita la comparsa di fenotipi.

L'informazione genetica consiste principalmente di istruzioni per produrre proteine che svolgono le funzioni cellulari. I geni sono contenuti nei cromosomi, addensamenti di DNA e proteine.

Nel 1953, Watson e Crick scoprirono la struttura del DNA, rendendo possibile la scoperta della replicazione dell'informazione in esso contenuta e del modo in cui il DNA codifichi le istruzioni per produrre proteine. Già prima dei due scienziati, Marie Curie riuscì a distinguere con la diffrazione a raggi X la struttura a doppio filamento a elica del DNA.

Struttura del DNA

Una molecola di DNA è composta da due catene (o filamenti) di nucleotidi tenuti insieme da legami fosfodiesterici, creati grazie alla presenza di un gruppo fosfato (Pi), che si differenziano in base alla base azotata che vi è legata. I due filamenti sono antiparalleli e sono tenuti insieme da legami idrogeno tra le basi, le quali tendono a posizionarsi verso l'interno della molecola.

I nucleotidi del DNA sono formati dallo zucchero deossiribosio, un gruppo fosfato e una base che può essere adenina (A), citosina (C), guanina (G) o timina (T). I nucleotidi sono uniti covalentemente fra loro sui carboni 3 e 5, quindi rimangono libere le estremità 5’ e 3’ alla fine delle catene. Il diametro della molecola di DNA è costante (2nm), ma purine e pirimidine hanno dimensioni diverse (purine a due anelli eteroatomici A e G, pirimidine a singolo anello esatomico C e T), per questo una purina è sempre legata a una pirimidina, in particolare A con T (doppio legame) e G con C (triplo legame); per appaiamento complementare delle basi, infatti, in base alla regola di Chargaff, si sa che il numero di purine e di pirimidine in una molecola di DNA è lo stesso.

Duplicazione del DNA

Ogni filamento del DNA può agire da stampo per la sintesi di un nuovo filamento complementare per duplicare il suo genoma e trasmetterlo. La sequenza dei nucleotidi di un gene codifica la sequenza degli amminoacidi di una proteina grazie al processo di espressione genica o traduzione. L’insieme di tutti i geni e quindi di tutte le informazioni del DNA è il genoma, che contiene le istruzioni per sintetizzare gli RNA e le proteine necessarie per l’organismo.

Organizzazione del DNA

La maggior parte del DNA di una cellula eucariotica si trova nel nucleo delimitato da un involucro nucleare formato da due doppi strati lipidici attraversati da pori nucleari che trasportano molecole fra il nucleo e il citosol. L’involucro nucleare è connesso direttamente al reticolo endoplasmatico che indirizza le proteine tradotte nella parte della cellula dove devono agire.

Nell’uomo il DNA è suddiviso in 46 cromosomi, ciascuno dei quali consiste in una molecola di DNA associato a proteine che la impacchettano e compattano formando così la cromatina.

Divisione del genoma

La divisione del genoma in cromosomi dipende dalla specie eucariotica. Escludendo le cellule germinali (oociti e spermatozoi) e pochi tipi di cellule prive di DNA (come i globuli rossi), ciascuna cellula umana contiene 46 cromosomi (cariotipo): 22 coppie comuni a maschi e femmine, e due cromosomi sessuali (X e Y nei maschi, due X nelle femmine). Le coppie di cromosomi sono formate da cromosomi omologhi provenienti uno dalla madre e uno dal padre. L’unica coppia di cromosomi non omologhi sono i cromosomi sessuali nei maschi, X e Y.

I cromosomi possono essere distinti con una tecnica basata sull’ibridazione del DNA, per cui i filamenti di acido nucleico vengono etichettati con un colorante fluorescente che riconosce il suo DNA complementare. Il genoma umano è composto da circa 93,2x10⁶ coppie di nucleotidi di cui 21.000 geni codificanti per proteine e molte migliaia codificanti per molecole di RNA che non producono proteine. La maggior parte del DNA non è codificante (introni) e interrompe i segmenti che codificano per proteine (esoni). Ciascun gene è associato a sequenze regolatrici per regolare l’espressione genica.

Struttura dei cromosomi

Sui cromosomi, una sequenza nucleotidica agisce da origine di replicazione (ORI), il punto dove inizia la duplicazione del DNA (nei cromosomi eucariotici sono molte), una costituisce il centromero del cromosoma, dove i cromosomi duplicati vengono legati al cinetocore permettendo la separazione dei due cromatidi fratelli durante la divisione cellulare, e una forma i telomeri, le estremità dei cromosomi. I telomeri contengono sequenze ripetute per proteggere le estremità del cromosoma dai sistemi di riconoscimento di DNA spezzati da riparare.

Al DNA nei cromosomi si legano due classi di proteine per formare la cromatina: gli istomi e le proteine non istoniche. Il DNA si avvolge attorno agli istomi grazie alla sua carica negativa (gli istomi hanno carica positiva) formando i nucleosomi, che consistono in un complesso di otto proteine istoniche (ottamero istonico), ovvero due molecole di ciascun istomo H2A, H2B, H3 e H4, e DNA a doppio filamento. Tra un nucleosoma e l’altro ci sono tratti di DNA linker. La struttura della cromatina deve essere dinamica per permettere alla cellula di accedere al DNA per duplicarlo.

Tipi di cromatina

Esistono due tipi di cromatina: l’eterocromatina più condensata e l’eucromatina meno condensata. L’eterocromatina rappresenta il 10% della cromatina cellulare ed è concentrata nei centromeri e nei telomeri, ma è anche il motivo per cui uno dei due cromosomi sessuali femminili è disattivato (corpo di Barr). I fattori di trascrizione reclutano degli enzimi per farli agire su siti della cromatina modificando la struttura degli istoni nel momento della trascrizione per regolare l’espressione dei geni.

Replicazione, riparazione e ricombinazione del DNA

L’informazione genetica viene duplicata attraverso la replicazione del DNA e trasmessa alle cellule figlie. Ma il DNA è soggetto a continui danni a causa di composti chimici e radiazioni, quindi esistono dei sistemi di sorveglianza e riparazione del DNA affinché non avvengano mutazioni, cambiamenti permanenti che possono anche distruggere l’organismo.

Divisione cellulare

Le cellule di un organismo eucariotico si dividono in somatiche, che compongono il corpo dell’organismo, e germinali, che trasmettono l’informazione genetica dal genitore alla progenie. Cambiamenti nucleotidici nelle cellule somatiche possono dare origine a cellule che proliferano rapidamente a spese del resto dell’organismo generando un cancro.

Processo di replicazione del DNA

Durante la replicazione, il DNA viene usato come stampo, quindi la doppia elica si separa e l’enzima DNA polimerasi polimerizza i nucleotidi complementari al filamento stampo, per questo si dice che la replicazione del DNA è semiconservativa. Prima però è necessaria l’aggiunta di un deossiribonucleotide all’estremità 3’, detto primer, appaiato al filamento stampo. Il filamento di DNA nuova polimerizza nella direzione 5’-3’ perché i nucleotidi aggiunti all’estremità 3’ della nuova catena portano il trifosfato necessario per il legame covalente. La replicazione è favorita dal rilascio di pirofosfato che viene idrolizzato.

Forcella di replicazione

La replicazione del DNA ha inizio dalla formazione di una forcella di replicazione dove la DNA polimerasi inizia la polimerizzazione del nuovo filamento in direzione 5’-3’. Quindi uno dei due filamenti sarà sintetizzato in direzione opposta unendo frammenti di Okazaki con l’impiego della DNA ligasi. Il filamento sintetizzato in 5’-3’ è detto filamento veloce, mentre quello in 3’-5’ è un filamento lento.

Correzione delle mutazioni

Uno dei sistemi di controllo che permette al DNA di correggere le mutazioni durante la duplicazione è la DNA polimerasi che agisce sulle basi appaiate in maniera scorretta. Questo avviene innanzi tutto perché l’appaiamento di una base complementare è energeticamente più favorevole, poi perché la DNA polimerasi ha un sistema di controllo basato sulla geometria dei due filamenti su cui lavora riconoscendo l’errore prima che il nucleotide venga legato covalentemente alla sequenza. Se un nucleotide errato viene legato in modo covalente alla catena entra in gioco la correzione delle bozze: la DNA polimerasi si blocca perché il primer ha all’estremità 3’-OH un nucleotide che non permette la prosecuzione della sintesi, dopodiché utilizza una esonucleasi che taglia il terminale del primer fino a quando 3’-OH non ritorna ad essere funzionale per la duplicazione. Se l’errore supera entrambi questi meccanismi interviene il mismatch repair.

Filamenti e primer

Il filamento veloce ha bisogno di un solo primer perché la DNA polimerasi ha sempre un’estremità dove aggiungere nuovi nucleotidi. Sul filamento lento ogni frammento di Okazaki ha bisogno di un primer perché la DNA polimerasi deve sintetizzare un altro frammento da zero. I diversi primer vengono sintetizzati dalla DNA primasi come primer a RNA lunghi una decina di ribonucleotidi. Così si va a formare una doppia elica ibrida formata da RNA e DNA con sequenze complementari. La sintesi dei frammenti di Okazaki termina quando la DNA polimerasi incontra il primer a RNA del filamento precedente, ma prima i primer RNA devono essere sostituiti con DNA grazie a un altro sistema di riparazione.

Proteine specifiche per la replicazione

La doppia elica del DNA è molto stabile, quindi per svolgerla servono delle proteine specifiche: le DNA elicasi e le SBS. Le DNA elicasi idrolizzano ATP quando sono legate a filamenti singoli di DNA e scorrono sul filamento aprendo l’elica, le SBS si legano al filamento singolo stabilizzando la conformazione svolta del DNA e raddrizzandolo.

La DNA polimerasi tende a dissociarsi dal DNA appena finito di sintetizzare un frammento di Okazaki in modo da poter iniziare la sintesi del frammento successivo. Sul filamento veloce invece questa dissociazione è evitata grazie a una pinza scorrevole (β-clamp o PCNA) che tiene attaccata la polimerasi sul DNA e la rilascia quando la polimerasi incontra una regione di DNA a doppio filamento. La PCNA ha la forma di un anello di cui un lato si lega alla DNA polimerasi e il resto dell’anello scorre lungo il DNA. L’assemblaggio della pinza richiede ATP, idrolizzata da un caricatore che riconosce la regione di DNA dove si è appaiato il primer e vi si avvolge. Il caricatore porta la pinza fino all’estremità 3’ del primer dove idrolizza ATP e rilascia la pinza. La DNA polimerasi sul filamento lento usa la pinza che però si stacca ogni volta che raggiunge l’estremità 5’ del frammento di Okazaki.

Inizio e fine della replicazione

Davanti alla forcella di replicazione la DNA elicasi apre l’elica del DNA. Due molecole di DNA polimerasi sono in funzione a livello della forcella, una sul filamento veloce e una sul filamento lento. Su quest’ultimo il complesso della replicazione lascia dietro di sé una serie di frammenti di Okazaki non uniti, che contengono ancora alle estremità 5’ l’RNA primer. Questo viene rimosso e il buco riempito grazie a enzimi di riparazione del DNA.

I due filamenti del DNA devono essere svolti e separati per far avvenire la replicazione. A questo serve la DNA topoisomerasi, una nucleasi che si attacca covalentemente a un fosfato del DNA per rompere un legame fosfodiestere nel filamento. La topoisomerasi I, si lega a un solo filamento producendo una rottura e permettendo la rotazione delle due sezioni del filamento per svolgersi. La topoisomerasi II, forma un legame covalente con i due filamenti producendo una rottura su entrambi. A questo punto, la proteina usa ATP per rompere reversibilmente la doppia elica e risaldare la rottura dissociandosi dal DNA. In questo caso la topoisomerasi serve a sciogliere i superavvolgimenti aggrovigliati dei cromosomi.

Proteine iniziatrici

La doppia elica del DNA è molto stabile, perciò per avviare la replicazione servono delle speciali proteine iniziatrici che si legano ai due filamenti e li separano rompendo i legami idrogeno fra le basi in una porzione di DNA chiamata ORI (origine di replicazione). Queste sequenze si trovano spesso in corrispondenza di porzioni ricche di coppie A-T perché sono legate da meno legami idrogeno rispetto alle coppie G-C. I cromosomi batterici hanno una sola ORI, mentre i cromosomi eucariotici ne hanno multiple in modo da rendere più veloce la replicazione. Le cellule batteriche riproducono il proprio DNA continuamente, mentre le cellule eucariotiche solo durante la fase S del ciclo cellulare.

ORI e proteine

Un’ORI deve avere un sito di legame per una proteina iniziatrice ORC (complesso di riconoscimento dell’origine), un tratto di DNA ricco di A e di T facile da separare e siti di legame per proteine che aiutino l’ORC a legarsi al DNA modificando la struttura della cromatina. Durante la fase G1, le elicasi sono caricate sul DNA vicino a ORC per creare un complesso prereplicativo. Tra la fase G1 e la fase S, le chinasi attivano le elicasi aprendo la doppia elica e permettendo il caricamento delle altre proteine, tra cui le DNA polimerasi. Le stesse chinasi impediscono l’assemblaggio di nuovi complessi prereplicativi finché non si passa alla fase M, fosforilando ORC, non permettendogli di accettare nuove elicasi.

Telomeri e telomerasi

Alle estremità dei cromosomi sono presenti delle sequenze speciali che contengono molte ripetizioni in tandem: i telomeri. I telomeri sono mantenuti dall’enzima telomerasi che allunga le estremità del cromosoma in direzione 5’-3’ usando un primer a RNA. I telomeri hanno bisogno di essere protetti dai sistemi di riparazione del DNA, perciò una nucleasi accorcia l’estremità 5’ del telomero, lasciando sporgere un’estremità a singolo filamento che attrae delle proteine che formano un cappuccio protettivo, lo shelterin, che nasconde i telomeri ai controllori del danno cellulare. I telomeri comunque vengono accorciati gradualmente: dopo molte generazioni, le cellule ereditano cromosomi senza funzionalità telomerica e perciò attivano una risposta al danno al DNA smettendo di dividersi. I telomeri servono come protezione dalla proliferazione incontrollata di cellule nei tessuti.