Riassunto esame Biochimica, Prof. Marcocci Lucia, libro consigliato Principi di biochimica, Lehninger

A=T.

Né la DNA polimerasi né i sistemi di riparazione si rendono conto dell’errore. Quando si replica il

presenta l’errore con la timina, si ha una mutazione vera e propria (può essere più o

filamento che

meno silente). 160

Riparazione diretta

Vi sono sistemi che possono riparare le metilazioni ed un esempio è la riparazione diretta. Questo,

però, è un sistema costoso perché per rimuovere la metilazione si utilizza un enzima particolare,

ovvero l’O metilguanina transferasi. Inizialmente si ha la trasformazione della O -metilguanina: la

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guanina si appaia con T ed introduce la mutazione G-C/A-T. A questo punto opera la O -metilguanina

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metiltransferasi (MTGMT) che non è un vero e proprio enzima. Infatti, rimuove il metile del

nucleotide metilato, legandolo su una cisteina ma in questo processo la proteina si inattiva. L’utilizzo

di un'intera proteina è indicativo di quanta energia il sistema spende per conservare inalterato il

materiale genetico.

Un altro meccanismo importante è la trasformazione della 1-metiladenina e della 3-metilcitosina,

molecole in cui il metile si trova sull’azoto della pirimidina. Questi meccanismi di riparazione diretta

avvengono nei batteri dal momento che si verificano molto velocemente e i batteri necessitano un

tempo di replicazione breve. Questi processi vengono svolti ad opera della proteina ALKB, una

substrato delle molecole atomi di ossigeno) α-chetoglutarato

diossigenasi (enzimi che inseriscono nel

dipendente. L’ α-chetoglutarato

Fe è una molecola di glutammato che ha perso il gruppo amminico

2+

sul Cα e, al suo posto, presenta un gruppo chetonico. Questa molecola:

1. quando agisce sulla metiladenina viene trasformata in succinato poichè la proteina ALKB

inserisce un gruppo metossi; la molecola ottenuta viene poi staccata sottoforma di aldeide,

liberando l’anello di azoto dal metile, ottenendo l’adenina

2. quando agisce sulla metilcitosina viene trasformata in succinato poichè la proteina ALKB

inserisce un gruppo metossi; la molecola ottenuta viene poi staccata sottoforma di formaldeide

e si ottiene la citosina.

!! conoscere struttura alfa cheto glutarato 161

RIPARAZIONE SOGGETTA AD ERRORI

I processi di riparazione si devono attivare prima che inizi la replicazione per far sì che questa non si

blocchi. Tuttavia, se la forcella di replicazione giunge in una zona in cui c’è una lesione o una rottura

non riparata, la replicazione si blocca e si attivano due tipi di processi di riparazione:

 Riparazione soggetta ad errori: è provocata dalla risposta SOS e vi operano DNA polimerasi

poco accurate quale la DNA polimerasi IV e V dei batteri e la β, η, θ, ι, e λ degli eucarioti,

assistite da varie proteine indotte durante il processo di riparazione. La riparazione è poco

accurata e vengono inserite mutazioni.

 Ricombinazione: in assenza della catena integra che funge da stampo per la catena

danneggiata, si usa come stampo il filamento del cromosoma omologo.

Ricombinazione del DNA

La ricombinazione è un altro tipo di metabolismo di DNA durante il quale il riarrangiamento

dell'informazione genica avviene all’interno di una molecola di DNA o tra molecole diverse. Esistono

tre tipi di ricombinazione:

 Ricombinazione genica omologa (ricombinazione generale): consiste in uno scambio di

materiale genico tra molecole diverse di DNA o segmenti della stessa molecola che hanno in

comune un'ampia regione di sequenze quasi identiche.

Permette:

 Il riparo di diversi tipi di danno del DNA (riparazione mediante ricombinazione).

 Il contatto fisico dei cromosomi per la segregazione dei cromosomi omologhi durante

la meiosi (processo che avviene sulle cellule germinali).

 La formazione di crossing over e lo scambio di segmenti tra cromosomi diversi,

processo che contribuisce alla diversità genica in una popolazione.

 Trasposizione di DNA: consiste in uno spostamento di una breve sequenza di DNA da una

parte all’altra della molecola di DNA (i geni “saltano”).

 Ricombinazione sito-specifica: lo scambio avviene solo in corrispondenza di sequenze

definite di DNA. Questo tipo di ricombinazione, per esempio, permette al DNA di un virus di

inserirsi nel DNA di una cellula ospite in quanto a livello dei due DNA sono presenti sequenze

simili che si ricombinano.

Ricombinazione genica omologa

La ricombinazione genica omologa assicura:

 Scambio di segmenti tra cromosomi diversi

 Diversità genica in una popolazione. Richiede, infatti, contatto fisico dei cromosomi e avviene

durante la coniugazione batterica e la segregazione durante la meiosi negli eucarioti.

 Formazione di crossing-over

 Riparo di diversi tipi di danno del DNA batterico (riparazione mediante ricombinazione del

DNA) 162

La ricombinazione genica omologa viene suddivisa in diversi step:

1. La rottura di uno dei due omologhi viene

convertita in un’interruzione a opera di esonucleasi.

Le estremità 3’ dei filamenti vengono degradate meno

velocemente delle estremità 5’. Ne deriva la

produzione di estensioni delle estremità 3’ dei

filamenti

Un’estremità 3’ esposta si appaia con il suo

2.

filamento complementare nell’omologo intatto.

L’altra catena del DNA a doppio filamento viene

spostata.

L’estremità 3’ che ha invaso il cromosoma

3.

omologo viene allungata per azione della DNA

polimerasi e per migrazione della ramificazione,

generando, infine, per azione di un secondo evento di

cattura dell’estremità, una molecola di DNA con due

incroci (crossover) sottoforma di strutture ramificate

chiamate intermedi di Holliday.

L’ulteriore replicazione

4. del DNA rimpiazza il

DNA mancante a partire dal sito originale di rottura

della doppia elica

5. Nucleasi specializzate, chiamate resolvasi degli

intermedi di Holliday, scindono l’intermedio di

Holliday, producendo entrambi i prodotti di

ricombinazione. Nel prodotto 2 viene ricombinato il

DNA su entrambi i lati della regione sottoposta a

riparazione.

Nella ricombinazione genica omologa, dunque, sono

richiesti diversi passaggi:

 Allineamento dei cromosomi omologhi

 Rottura dei filamenti di DNA

 Amplificazione della rottura della doppia elica di

DNA per il processamento dell’estremità 5’ e per la

formazione del singolo filamento con estremità 3’,

che invade il duplex di DNA intatto. 163

Riparazione mediante ricombinazione del DNA

di replicazione incontra un’interruzione su uno dei due filamenti stampo, viene

Quando una forcella

preso un braccio della forcella e la forcella di replicazione collassa. L’estremità 5’ del filamento a

livello dell’interruzione viene degradata per creare un’estensione 3’ a singolo filamento, che viene

poi utilizzato in un processo di invasione del filamento, accoppiando il filamento singolo con il

filamento a esso complementare presente all’interno del doppio filamento adiacente. La migrazione

della ramificazione (rappresentata nel riquadro) può creare un intermedio di Holliday. La scissione

dell’intermedio di Holliday da parte di nucleasi specializzate, seguita dalla ligazione, ristabilisce una

forcella di replicazione funzionante. Il replisoma viene ricaricato su questa struttura (non mostrata) e

la replicazione continua. Le punte delle frecce rappresentano le estremità 3’.

Trasposizione del DNA: meccanismo del trasposone

La ricombinazione può avvenire attraverso il trasferimento di elementi trasponibili, detti trasposoni.

I trasposoni sono segmenti di DNA, presenti in tutte le cellule, che si spostano o "saltano" da un punto

di un cromosoma (il sito donatore) a un altro nello stesso cromosoma o in uno diverso (il sito

bersaglio). Nei batteri sono presenti due classi di trasposoni:

 Le sequenze di inserzione (trasposoni semplici): contengono solo sequenze necessarie alla

loro trasposizione e geni per le proteine (trasposasi) che mediano il processo.

 I trasposoni complessi: contengono uno o più geni soprannumerari rispetto a quelli necessari

per la trasposizione. Questi geni aggiuntivi, per esempio, potrebbero conferire resistenza agli

antibiotici e quindi aumentare le possibilità di sopravvivenza della cellula ospite.

I trasposoni batterici, quindi, possiedono una struttura variabile ma la maggior parte possiede alle due

estremità brevi sequenze ripetute che servono da sito di attacco per la trasposasi. 164

Le sequenze duplicate a seguito dell’inserzione del

trasposone sono mostrate in rosso. Queste sequenze,

generalmente, sono lunghe solo poche coppie di

basi, quindi nella figura la loro lunghezza relativa è

sensibilmente maggiore che nella realtà.

Il processo di spostamento dei trasposoni è detto trasposizione e può seguire due tipi di meccanismo

in base al tipo di trasposone presente:

1. Trasposizione semplice o diretta:

1. Vengono effettuati tagli su ciascun lato del trasposone per staccarlo e il trasposone si

sposta in una nuova posizione.

2. Ciò lascia una rottura nella doppia elica di DNA, che deve essere riparata.

3. In corrispondenza del sito bersaglio viene praticato un taglio sfalsato.

4. Il trasposone viene inserito nel sito di taglio e un processo di replicazione del DNA

riempie la rottura per duplicare la sequenza del sito bersaglio.

Trasposizione replicativa: l’intero

2. trasposone viene replicato in modo tale che una copia venga

lasciata nel sito donatore originario. Un cointegrato è un intermedio di quest'ultima reazione,

in cui la regione donatrice è legata covalentemente al DNA del sito bersaglio. In questo

intermedio sono presenti due copie complete del trasposone, disposte con lo stesso

orientamento presente nel DNA. In alcuni trasposoni ben caratterizzati l'intermedio viene

convertito in prodotto per mezzo della ricombinazione sito-specifica, in cui ricombinasi

specializzate catalizzano la reazione di delezione necessaria.

Ricombinazione sito-specifica

Avviene a livello di determinate sequenze di DNA, costituite da 20-200 basi. Viene operata da enzimi

specifici detti ricombinasi:

 Integrasi: classe di ricombinasi sito-specifiche che utilizzano un residuo di tirosina come

nucleofilo nel loro sito attivo. La tirosina presente a livello del sito attivo possiede il gruppo -

OH nucleofilo, che si inserisce all’interno del legame fosfoesterico che tiene uniti due residui

di zucchero. L’inserimento avviene a seguito della competizione dell’OH della tirosina con

l’OH del ribosio per legarsi al fosfato del filamento di DNA.

 Resolvasi/invertasi: classe di ricombinasi sito-specifiche che utilizz