Quinta parte appunti Biologia

RER/REL.

È una via che interessa circa 1/3 delle

proteine cellulari ed è stata individuata

negli anni ’70 da due ricercatori che

hanno marcato degli amminoacidi con

sostanze radioattive e li hanno esposti a

cellule ghiandolari in coltura. È stato visto che dopo un periodo d’incubazione le cellule

producevano proteine radioattive e alcune di esse, che venivano inizialmente trovate nel

reticolo, a distanza di poco tempo si localizzavano nel Golgi, poi nelle vescicole di

secrezione e successivamente fuori dalla cellula. Quindi si è ipotizzata una nuova via

secretoria che è stata ulteriormente studiata per verificare con quali modalità avvenisse

(esperimenti di pulse-chase).

Nello spazio interno cisternale del reticolo ruvido finiscono quindi alcune proteine. È

importante dire inoltre che i ribosomi che stanno nel citosol e quelli nel RER non sono

diversi, ma sintetizzano semplicemente proteine con destinazioni diverse.

Come fanno i ribosomi a decidere se andare o meno nel reticolo? Gli stessi ricercatori degli

esperimenti di pulse-chase, hanno compreso che molte

proteine, in particolari quelle destinate alla secrezione,

erano più corte una volta secrete rispetto a quelle che si

trovavano inizialmente nel reticolo. Per questo è stato

ipotizzato che ci potesse essere una sequenza

aggiuntiva che serviva come segnale (ipotesi del

segnale), successivamente verificato. Le proteine infatti

presentano all’N-terminale una sequenza di 15-40

amminoacidi di un certo tipo che indicano il “destino” di quella proteina detta sequenza

segnale. Invece le proteine che rimangono a “lavorare” nel citosol non hanno sequenza

segnale.

Perciò i ribosomi si legano all'mRNA e con il tRNA cominciano a sintetizzare la proteina e

appena emergono dal ribosoma i primi 40 amminoacidi, la destinazione della proteina

potrebbe essere già riconosciuta dalla cellula che riconosce la

sequenza della catena. Già all’inizio si distinguono quindi le

proteine che seguono la via post-traduzionale e quelle che

seguono la co-traduzionale. L’RNA, perciò, presenterà dei codoni

al 5’ che codificano per gli amminoacidi della sequenza segnale.

La sequenza segnale non viene mantenuta, infatti la proteina si

presenta più corta perché la sequenza viene tagliata ed eliminata.

L’importanza della sequenza segnale si è vista grazie ad

esperimenti di ingegneria genetica dove sono state aggiunte

sequenze segnale a proteine citosoliche (normalmente prive) che

sono state poi importate nel reticolo endoplasmatico. Allo stesso modo, tagliando la parte

del RNA che codifica la sequenza segnale di una proteina, questa rimane nel citosol.

Le strutture proteiche dell'organulo di destinazione che riconoscono la proteina sono dette

traslocatori di membrana o trasloconi: la sequenza segnale riconosce la parte interna dei

trasloconi (come dei canali) e consente al traslocone di aprirsi per farlo passare nella

membrana dell’organulo. Normalmente il traslocone è dunque chiuso per evitare scambi non

selettivi, tramite un dominio proteico che occlude il poro interno e si apre quando arriva la

proteina, cambiando conformazione. La proteina che passa all’interno dei trasloconi non è

ancora conformata. Sui traslocatori si adagiano anche i ribosomi perché “trascinati” dalla

sequenza segnale.

Co-traduzione in corrispondenza del reticolo ruvido: per quanto riguarda l’importazione

co-traduzionale nel reticolo ruvido bisogna capire in che modo la sequenza segnale arriva al

traslocone, perchè non c’è contatto immediato e diretto tra sequenza segnale e traslocatore:

c’è un intermediario, ovvero una particella ribonucleoproteica che si chiama SRP (signal

recognition particle, ovvero particella di riconoscimento del segnale) e si trova nel citosol. È

questa particella a riconoscere la sequenza segnale e a trasportare il ribosoma con la

proteina in fase di sintesi alla membrana del reticolo dove ci sono i traslocatori.

Nei mammiferi l’SRP è costituito da sei subunità proteiche e da un RNA citoplasmatico di

dimensioni di 7S. In esso ci sono diversi domini:

-uno lega il GTP, con attività gtpasica

-un sito di legame per la sequenza segnale

-un dominio di pausa della traduzione, che è quello che blocca momentaneamente la

traduzione: intercetta il ribosoma e si posiziona sul suo sito A per impedire l’aggiunta di un

nuovo tRNA.

L’SRP deve poi portare il complesso alle membrane del reticolo in corrispondenza del

traslocone, dove vi è un recettore, cioè un dominio proteico, per SRP.

Vicino alla parte centrale del traslocone infatti (il canale centrale è costituito da proteine

sec61) vi è non solo il recettore per SRP ma anche un’altra proteina detta peptidasi del

segnale che taglia la sequenza segnale quando non serve più.

Quando l’SRP si lega al recettore si scatena l’attività gtpasica, che consiste nella

degradazione del GTP in GDP, e allo stesso tempo anche il recettore fa la stessa cosa.

Dopo la degradazione dei GTP un cambiamento conformazionale stacca la sequenza

segnale che va a legarsi col poro del traslocone. A questo punto SRP cambia nuovamente

conformazione e si stacca dal recettore. La sintesi proteica può quindi riniziare, e durante la

sintesi la proteina ricade nel lume del reticolo; in seguito, la peptidasi taglia la sequenza

segnale di modo che la proteina possa essere rilasciata e il poro del traslocone si chiuda.

Questo procedimento vale per le proteine solubili,

ovvero quelle destinate alla secrezione o agli organuli

del sistema endomembranoso.

La sequenza segnale a livello della peptidasi viene

localizzata nella membrana del reticolo per poi essere

degradata: è stato studiato mediante cristallografia a

raggi X che è il traslocone stesso a fare

quest’operazione; infatti, si è visto che oltre ad avere un’apertura centrale ha anche una

commissura (apertura) laterale. È stato studiato che il traslocone continua a variare la sua

conformazione in modo casuale tra la chiusura e apertura della commissura laterale. Nella

fase di apertura, ciò che è abbastanza idrofobico e che passa dal poro centrale può

trasferirsi verso la membrana. Questa scoperta è importante perché porta all’ipotesi,

confermata, sulla modalità con cui vengono sintetizzate invece le proteine di membrana. Le

proteine di membrana invece hanno caratteristiche diverse dalle proteine solubili viste;

infatti, hanno le sequenze segnale non posizionate al N-terminale (e altre segnalazioni

localizzate nel resto della catena).

Come avviene l’inserzione delle proteine di membrana nel reticolo durante l’importazione

co-traduzionale?

Es: proteina transmembrana monopasso, che ha il C-terminale fuori nel citosol e

l’N-terminale dentro (proteine di tipo 1), viene sintetizzata grazie alla sequenza segnale

che lega con il traslocone del reticolo. La catena polipeptidica è dotata anche di una

sequenza idrofobica interna, che è chiamata sequenza di stop: man mano che la sintesi

procede la sequenza di stop entra nel traslocone e viene riconosciuta e trattenuta, per poi

passare nell’apertura laterale ed entrare nella membrana plasmatica, a causa di un’affinità

chimica maggiore. Quindi la parte della proteina entrata nel lume del RE rimane lì, la

sequenza di stop viene localizzata nella membrana e la restante parte della proteina non

ancora entrata nel reticolo, compreso il C-terminale, rimane nel citosol.

Può avvenire anche la situazione inversa

(proteine di tipo 2): l’N-terminale rimane nel

citosol e il C-terminale nel lume del reticolo. In

questo caso la sequenza segnale non è a

livello del N-terminale ma è più interna nella

catena polipeptidica, quindi la proteina

comincia ad essere sintetizzata nel citosol,

quando emerge la sequenza segnale interna il

ribosoma viene guidato alla membrana del

reticolo e avviene lo stesso processo: la

sequenza segnale lega con il traslocone e la

sintesi continua. Questa sequenza, tuttavia, non viene tagliata dalla peptidasi del segnale

ma alla fine della sintesi la proteina viene trasferita lateralmente nella membrana, con

l’N-terminale fuori, il segnale attraversa la

membrana e la prima parte della proteina

con il C-terminale è nel lume.

Le proteine multipasso hanno sequenze

di inizio trasferimento e sequenze di

stop all’interno della catena polipeptidica.

La sequenza di inizio trasferimento fa sì

che la proteina inizi il trasferimento tramite

il traslocone all’interno del lume, fino a

quando nel traslocone entra la sequenza di

stop, che è idrofobica: si ha uno

spostamento di essa nella membrana del reticolo; in seguito, un’altra parte della proteina ha

una sequenza di inizio che si lega

con il traslocone e avviene il

medesimo processo più volte, di

modo che la proteina multipasso

possa entrare diverse volte nella

membrana. Man mano che il

polipeptide entra nel reticolo viene

intercettato da proteine residenti nel

reticolo che si chiamano proteine BiP (famiglia HsP70 degli chaperoni): hanno il ruolo di

legare via via che entra la proteina per impedire che fuoriesca di nuovo.

A volte nel reticolo è anche possibile l’importazione post-traduzionale: ci sono anche

recettori e traslocatori di proteine completamente sintetizzate nel citosol.

Le proteine che entrano nel reticolo subiscono delle modificazioni durante la sintesi

(co-traduzionali) e dopo (post-traduzionali). Le modificazioni sono:

N-glicosilazione: vengono aggiunti degli zuccheri alla proteina, in particolare un

o core oligosaccaridico di 14 zuccheri che si lega al NH tramite un’enzima detto

2

oligosaccaril transferasi. È tipica del reticolo, mentre l’O-glicolisazione è tipica del

Golgi.

Un particolare lipide, il dolicolo fosfato, che è un terpene e

si trova nelle membrane del RER viene utilizzato come

vettore dei 14 zuccheri che legheranno la proteina: in

particolare dal dolicolo fosfato, tramite degli enzimi vengono

aggiunti degli zuccheri sul lato citosolico delle membrane

del reticolo. Vengono aggiunte 2 N-acetilglucosammine, 5

mannosi, e poi a un certo punto in seguito ad un movimento

di flip flop del dolicolo fosfato la catena oligosaccaridica

continua ad essere allungata all’interno del lume del

reticolo, con l’aggiunta di altri 4 mannosi e di 3 glucosi. Alla

fine, si ha un’oligosaccaride ramificato di 14 zuccheri. Al

termine l’oligosaccaril-transferasi, taglia l’oligosaccaride in

blocco dal dolicolo fosfato e lo attacca ad una asparagina

del polipeptide in sintesi (l’asp