Nona parte appunti Biologia

REPLICAZIONE DEL DNA

La replicazione del DNA è semiconservativa: essendo il DNA costituito da due

filamenti avvolti a doppia elica, che si separano e ciascun filamento funge da

stampo per la sintesi di un nuovo filamento complementare.

Pertanto, le due molecole figlie avranno un filamento parentale e un filamento di

nuova sintesi, complementare al filamento parentale. Per arrivare a questa

scoperta ci sono stati diversi esperimenti che hanno confermato l'ipotesi

di Watson e Crick.

La separazione dei due filamenti della doppia elica avviene da diversi siti di inizio, localizzati

sul cromosoma, nei quali si originano delle unità di replicazione dette repliconi.

Queste specifiche zone che rappresentano le origini di replicazione, sono dette “ori” e sono

punti in cui ha inizio lo svolgimento e l'apertura della doppia elica. Sono caratterizzate da

una frequenza molto elevata di sequenze adenina-timina. In queste zone l'apertura è più

facile perché queste 2 basi sono legate tra di loro da 2 legami idrogeno anziché 3 (come tra

guanina e citosina). Queste zone ori nel lievito sono state studiate e vengono denominate

“elementi Ars” (Autonomously Replicating Sequences).

A queste origini di replicazione si lega un complesso proteico che attiva l’enzima elicasi,

capace di separare i due filamenti, rompendo i legami idrogeno tra le basi. Questo enzima è

bidirezionale, quindi si formano due forcelle di replicazione, che sono strutture a forma di Y.

Le forcelle si allontanano da ori in direzione opposte, formando una struttura, in cui i due

filamenti parentali sono separati, chiamata “bolla di replicazione” o replicone. Man mano che

le forcelle si allontanano la bolla diventa sempre più grande.

Quando una bolla incontra la bolla del replicone adiacente il DNA neosintetizzato dei due

viene unito ottenendo le due molecole di DNA.

Gli enzimi chiave in questo processo sono quindi:

- l’elicasi, che utilizza l'energia derivata dall'idrolisi

dell’ATP per svolgere il DNA e per rompere i legami

idrogeno tra le basi; si situa a monte della forcella di

replicazione su uno dei due filamenti, come se fosse un

anello, ed è costituito da sei subunità che avvolgono un

filamento muovendosi in direzione 5’ → 3’

- le proteine chiamate SSBP (Single Strand Binding

Proteins) cioè proteine che si legano ai singoli filamenti,

che hanno le basi esposte, con il compito di tenere svolto il DNA, per renderlo

accessibile alla DNA polimerasi ed evitare che si associano per affinità tra le basi

- un enzima, la topoisomerasi, che invece si trova a valle della forcella di

replicazione, dove crea dei punti di perno che facilitano lo svolgimento del DNA,

impedendo la formazione di superavvolgimenti. Questo enzima fa un lavoro di

rottura e risaldatura dei due filamenti, perché essendo i cromosomi molecole

molto lunghe, prima che si svolga tutta la molecola, si creano super avvolgimenti,

per l’elevata inerzia della lunga molecola

DNA POLIMERASI

L'attore principale della replicazione del DNA è la polimerasi che è un

enzima dal punto di vista strutturale molto somigliante alla mano destra

semi aperta: con il palmo che contiene il sito attivo dell'enzima e le

quattro dita conformate in modo da riconoscere la dimensione e la forma

dei diversi nucleosidi trifosfati. Quindi la polimerasi si basa su l'ingombro

sterico dei nucleosidi in modo da inserirli correttamente, in modo

complementare alle basi sul filamento stampo.

La polimerasi catalizza la formazione di un nuovo filamento usando come substrati i

desossinucleosidi trifosfati.

Perché vengono usati desossinucleosidi trifosfati e non nucleotidi?

Perché il legame fosfoanidride tra il primo e il secondo fosfato viene

idrolizzato, liberando molta energia, perché le cariche negative dei gruppi

fosfato si respingono e andando a togliere i due gruppi fosfato al

nucleoside trifosfato (che è già instabile di per sé) si stabilizza la

molecola. Quindi questa liberazione di energia è utile per favorire la

reazione e per la formazione del legame fosfodiestere tra i nucleotidi, in

particolare tra il gruppo fosfato in 5’ di un nucleotide e l’OH all'estremità 3’

del nucleotide precedente.

Grazie alla polimerasi i nucleotidi vengono quindi legati al filamento in accrescimento, con

un legame covalente, alla terminazione 3’ della catena in allungamento. La DNA polimerasi

non sa fare la cosa opposta: non sa aggiungere un nucleotide all'estremità 3’. Mentre

allunga il nuovo filamento, scorre sul filamento stampo in direzione opposta perché i due

filamenti che si appaiono devono essere antiparalleli. Entrambi i filamenti costituiscono lo

stampo, per cui se i due filamenti sono antiparalleli la DNA polimerasi dovrà muoversi in

senso opposto in uno dei due.

Su questo filamento stampo la polimerasi sintetizza un nuovo filamento che si allunga nella

direzione opposta all'apertura della forcella. La polimerasi qua si allontana dalla forcella di

replicazione e per questo bisogna aggiungere i nucleotidi in modo discontinuo.

Il primo filamento, che viene sintetizzato in modo continuo, prende il nome di “filamento

anticipato” (o filamento guida o filamento leader), invece l'altro filamento di nuova sintesi si

chiama “filamento ritardato”, perché viene sintetizzato in modo discontinuo, attraverso dei

corti frammenti polinucleotidici, chiamati “frammenti di Okazaki” (dal nome dello scopritore).

Considerando che la replicazione è bidirezionale ad ogni bolla di replicazione, alle due

forcelle la situazione si ribalta, cioè il filamento ritardato e quello anticipato sono opposti.

Perché non si è evoluto un enzima capace di sintetizzare il filamento in direzione opposta?

Perché la polimerasi ha la caratteristica di avere un'attività esonucleasica da 3’ in 5’, oltre

all’attività sintetica da 5’ in 3’. Questo significa che sa scindere il legame fosfodiesterico

rompendolo in direzione opposta, come se la polimerasi correggesse il suo operato e questa

attività è anche chiamata “correzione di bozze”.

La DNA polimerasi non è in grado di legare ex novo dei nucleotidi tra di loro ma deve

necessariamente avere un filamento già formato per aggiungere nuovi nucleotidi quindi la

sintesi di DNA inizia sempre con la formazione di corti inneschi di RNA, formati da un

enzima chiamato primasi (una particolare RNA polimerasi coinvolta solo nella replicazione

del DNA) Questo tratto di una decina di ribonucleotidi si chiama “RNA iniziatore” o “primer” e

serve come innesco.

Questo procedimento garantisce una maggiore fedeltà, perché all'inizio di una reazione è più

frequente l'inserimento di basi errate e quindi siccome il primer poi verrà rimosso, verranno

rimossi gli errori.

Nel filamento guida il primer è uno mentre per i frammenti di Okazaki esiste un primer per

ogni frammento. Il primer viene rimosso e sostituito da DNA via via che il filamento si

allunga, perché esiste una diversa DNA polimerasi, chiamata

“DNA polimerasi riparativa”, la quale si aggancia a un

frammento di Okazaki già formato e degrada il primer del

frammento successivo. Poi interviene un enzima chiamato

DNA ligasi, che lega i frammenti di Okazaki vicini in cui il

primer è già stato sostituito con DNA.

Le DNA polimerasi dei due filamenti sono accoppiate da un

connettore, che le unisce all’elicasi, nonostante scorrano in

senso opposto, ma ci sono anche delle proteine accessorie,

chiamate “proteine morsetto scorrevole”, che fissano le DNA polimerasi sul filamento stampo

facendole scorrere.

Si ipotizza che lo stampo del filamento ritardato sia in realtà ripiegato a formare una sorta di

ansa per cui si dispone parallelo all'altro filamento.

La bolla di replicazione ha quindi due forcelle dove ci sono le due polimerasi che si muovono

insieme, finché i vari repliconi arrivano ad unirsi, ottenendo a questo punto la formazione

delle due molecole di DNA figlie, dalla molecola parentale.

La velocità di replicazione è molto diversa negli eucarioti e nei batteri: non solo nei batteri

esiste una sola origine di replicazione nel cromosoma circolare, ma per di più negli eucarioti

ci sono gli istoni che disturbano lo svolgimento dell’elica. Nell’uomo, ad esempio, la velocità

è di 3000 nucleotidi al minuto, mentre in Escherichia Coli (batterio) è di 30.000 nucleotidi.

L'accuratezza della replicazione è molto elevata perché si stima un errore su un miliardo di

nucleotidi inseriti, ma la replicazione può essere meno accurata se influenzata da fattori

esterni, come ad esempio inquinanti. Il tasso di mutazione spontanea è dunque basso, ma

questo tipo di replicazione pone il problema del “end replication problem”:

Dopo la duplicazione della molecola parentale, le molecole figlie avranno il filamento

parentale e il nuovo filamento, che all'estremità 5’ ha un primer a RNA residuo che viene in

seguito rimosso come tutti, lasciando dei buchi ai telomeri, cioè all'estremità dei cromosomi.

Questo però comporta che ad ogni duplicazione il nuovo filamento sarà sempre più corto, a

causa della rimozione del primer che lascia dei buchi nel filamento; il problema è che non c'è

lo spazio fisico per formare un nuovo primer e quindi riempire il buco poiché la polimerasi

non sa colmare questo spazio se non ha un primer. I filamenti hanno quindi l’estremità 3’ più

lunga però il fatto che ci sia un accorciamento dei telomeri nelle cellule figlie ad ogni

duplicazione è un problema perché a un certo punto i telomeri non supportano più questo

accorciamento; quindi, la cellula può permettersi di fare una serie di duplicazioni

accorciando i telomeri fino ad un certo punto in cui la cellula non può più andare incontro a

replicazione del DNA perché andrebbe ad intaccare i geni. A questo punto la cellula vive

ancora a lungo ma non si replica più e va in senescenza replicativa.

Esistono alcune strategie per allungare il telomero, ma vengono attuate solo nelle cellule

staminali oppure nelle cellule tumorali, che hanno la capacità di riattivare un enzima tipico

delle cellule staminali, la telomerasi. Questo enzima è un complesso ribonucleoproteico,

cioè un complesso fatto da una parte proteica con funzione enzimatica e una parte a RNA,

che è una sorta di sequenza stampo (template) e si chiama subunità TERC RNA. Questa

subunità funziona come stampo p