Biologia cellulare

- LA VIA DI SEGNALAZIONE DI Wnt Β-CATENINA

Parlando di cellule staminali adulte, in particolare dopo aver descritto le cellule staminali delle

cripte intestinali multipotenti che risiedono in una specifica nicchia staminale e nel determinare

quello che è il comportamento della staminale stessa, abbiamo cominciato a parlare di una via

di segnalazione assai importante nella biologia delle cellule staminali, in quanto è una via alla

base del controllo della loro proliferazione (ma non solo). È la via di segnalazione di Wnt

(“wint”): ci occuperemo della via di segnalazione canonica di Wnt β-catenina.

La β-catenina nelle cellule epiteliali è associata a livello delle giunzioni aderenti alle caderine e

di fato è coinvolta nell’adesione cellula-cellula e collega caderine con microfilamenti di actina.

In questo caso parleremo di una β-catenina che non si trova a livello delle giunzioni aderenti,

ma è una β-catenina che in presenza di Wnt è essa stessa a traslocare nel nucleo, dove si

accumula e non viene degradata ed entrerà a far parte di un complesso trascrizionale che

permetterà la trascrizione di geni bersaglio di Wnt, assieme ad altri fattori al promotore di geni

target.

In immagine, sono rappresentati:

- il recettore Frizzled, recettore di Wnt di cui esistono diverse

isoforme. È un recettore accoppiato a G proteine e tipicamente

oltrepassa 7 volte la membrana plasmatica. Viene rappresentato

il sito del domino extracellulare a cui si legherà Wnt, il ligando

del recettore.

- Nella via canonica è previsto il coinvolgimento di un co-recettore, LRP (proteina collegata al

recettore delle lipoproteine) che, in presenza di Wnt legato a Frizzled, si associa e funziona da

co-recettore. Ha quindi un ruolo nell’attivare la cascata segnalatoria a valle.

A) In assenza di segnale Wnt:

Quando non è presente Wnt legato al recettore Frizzled, nel

versante citosolico, la β-catenina viene degradata: la β-catenina

è instabile in assenza di Wnt, cioè viene rapidamente degradata a

livello del proteosoma conseguentemente all’apposizione di

un’etichetta, una catena di poli-ubiquitine. Per questo la β-

catenina non si può accumulare: è instabile e viene rapidamente

degradata. La poliubiquitinazione della catenina, che la indirizza al

proteosoma (dove verrà degradata), avviene dopo che la β-

catenina viene fosforilata (P gialli) a livello di specifici residui. La

β-catenina fosforilata permette poi di essere poliubiquitinata.

L’aggiunta dei due gruppi fosfato avviene ad opera di 2 chinasi (in

immagine rosa e arancione): la CK1 (caseina chinasi 1) e GSK3 (glicogeno sintasi chinasi 3).

Al di là del nome, è importante mettere a fuoco che in assenza di Wnt la β-catenina è instabile e

viene degradata a livello del proteosoma. Per poter essere riconosciuta e poliubiquitinata, deve

prima essere fosforilata ad opera di queste due chinasi GSK3 CK1.

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Questi due enzimi non sono liberi nel citosol ma formano un complesso insieme a due proteine,

axina e APC, due proteina che di fatto tengono insieme il complesso proteico e permettono alle

due chinasi di svolgere il loro lavoro. Della proteina APC ne avevamo parlato: è quella proteina

codificata dal gene APC che è mutato in pazienti affetti da poliposi adenomatosa del colon, che non

ha nulla a che fare con il complesso che promuove l’anafase APC-ciclosoma di cui parleremo poi

quando ci occuperemo del ciclo cellulare.

Quindi in assenza di Wnt la via di segnalazione è spenta e la

trascrizione dei geni target nel nucleo accesi da Wnt, in

assenza di esso, è spenta. Considerando il tratto di DNA che

codifica per un prodotto target di Wnt, sul promotore di

questo vi è un complesso di fattori di trascrizione che

inibiscono la trascrizione, ovvero LEF1/TCF formano un

complesso con l’inibitore trascrizionale Groucho.

B) In presenza del ligando Wnt:

La situazione cambia radicalmente al momento dell’arrivo

del ligando Wnt. Ci aspettiamo che Wnt si leghi al suo

specifico recettore Frizzled, formando un complesso attivato

ligando-recettore a cui partecipa anche il co-recettore LRP.

Spostandosi nel versante citosolico, la β-catenina, che prima

era instabile e veniva degradata dal proteosoma, ora è

stabile e non viene degradata. La poliubiquitinazione

avveniva in seguito alla fosforilazione da parte delle due

chinasi, ma il complesso che teneva insieme le due chinasi,

formato da axina e APC, in questo caso è disassemblato in

presenza di Wnt e quindi il complesso non esiste. Alcuni dei

suoi componenti, infatti, vengono reclutati a livello del coda citosolica del co-recettore LRP. Infatti,

axina (marrone) è stata reclutata e inattivata a livello della coda citosolica del co-recettore LRP, la

cui coda è stata fosforilata dalle due chinasi CK1 e GSK3 che, in assenza di Wnt, fosforilavano la β-

catenina.

Per riassumere: in presenza di Wnt, il complesso che permetteva la fosforilazione e successiva

ubiquitinazione e che quindi indirizzava la β-catenina al

proteosoma è disassemblato.

Dato che la β-catenina è stabile, questa non viene degradata,

si accumula e trasloca all’interno del nucleo e sostituisce

Groucho, che in assenza di Wnt bloccava la trascrizione dei

geni bersaglio di Wnt. Adesso, invece, la trascrizione è on in

presenza di Wnt e quindi i geni bersaglio di Wnt sono accesi e

vengono trascritti grazie alla β-catenina stabile che si

accumula, spiazza Grocho e forma un complesso con i

coattivatori LEF1/TCF permettendo la trascrizione dei geni

bersaglio di Wnt. 2

Se questa via di segnalazione è un’importante via di proliferazione cellulare, ci aspettiamo che fra

questi geni regolati dalla via di Wnt β-catenina ci siano per esempio i geni codificanti le cicline D, il

gene che codifica per MIC, quindi tutti i prodotti proteici che svolgono un ruolo nella proliferazione

cellulare.

In condizione di assenza di Wnt, quando la trascrizione dei geni bersaglio di Wnt deve essere

off/spenta, la proteina APC contribuisce a formare il complesso che tiene salde le chinasi per

fosforilare la β-catenina (per indirizzarla alla degradazione).

➔ Se APC è mutata, perché è mutato il gene che codifica per la proteina APC, è chiaro che se APC

non funziona, il complesso che tiene insieme le chinasi non funziona. Ciò vuol dire che la β-

catenina è stabile, dato che non viene fosforilata, non viene poliubiquitinata e in seguito

degradata a livello del proteosoma. Anche in assenza di Wnt, se il gene codificante APC è

mutato e il complesso non funziona correttamente, la β-catenina si accumula, va nel nucleo,

spiazza Groucho e attiva la trascrizione dei geni bersaglio di Wnt che stimolano la proliferazione

cellulare. Ecco spiegato quelle enormi cripte in cui la proliferazione procede in modo

incontrollato quando è mutato il gene APC.

Quando parlavamo del compartimento staminale intestinale abbiamo detto che, nel tentativo di

delucidare i meccanismi molecolari alla base degli stimoli che regolano la proliferazione, si arriva a

comprendere l’importanza della via di Wnt anche studiando la proliferazione delle cellule staminali

intestinali e in parte la proteina APC che è un protagonista importante nella via di segnalazione:

quando è mutata, l’alterazione delle via di segnalazione ha delle profonde conseguenze nella

proliferazione stessa del compartimento staminale. Non a caso nell’80% dei tumori del colon umani

il gene che codifica la proteina APC è mutato.

Studi fatti su modelli animali in vivo hanno dimostrato l’importanza di questa via di segnalazione

canonica di Wnt β-catenina, non soltanto nel regolare la proliferazione cellulare ma anche il

differenziamento.

Parlando di una via di segnalazione importante nelle cellule staminali, abbiamo nominato due

processi:

- La proliferazione cellulare, che ha che fare con il mantenimento/ self-renewal della popolazione

cellulare;

- Il differenziamento: quando parliamo di cellule staminali, è importante considerare anche la loro

potenza differenziativa. La cellula staminale intestinale, quando si divide asimmetricamente, è una

cellula multipotente in grado di generare un progenitore, che poi si amplificherà in transito

permettendo la formazione di un numero di cellule sufficienti che prenderanno destini diversi

(enterociti, cellule enteroendocrine, mucipare…).

Quindi cerchiamo di capire come la via di segnalazione di Wnt possa influenzare anche il

differenziamento oltre che la proliferazione.

Sono stati fatti degli esperimenti utilizzando dei modelli animali murini (topi) in cui viene bloccata

l’espressione dei geni regolati da Wnt. A livello del promotore dei geni bersaglio di Wnt, quando la

loro trascrizione era accesa, oltre alla β-catenina vi erano i fattori di trascrizione LEF1/TCF. Adesso

facendo riferimento a topi knock-out (KO) per TCF4, in questi topi KO non ci potrà essere la

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trascrizione dei geni bersaglio di Wnt. Per cui questi topi muoiono subito dopo la nascita, non vi

sono cripte intestinali e non c’è rinnovamento intestinale, a conferma del ruolo cruciale di questa

via di segnalazione nel comparto staminale dell’intestino e non solo.

Sono stati fatti esperimenti con un approccio procedurale diverso, in cui la via di segnalazione di

Wnt veniva spenta, ma non bloccata durante lo sviluppo come nell’esempio dei topi KO per TCF4

→ veniva eliminata di colpo l’espressione della proteina APC in modelli murini animali condizionali.

Nei topi transgenici già maturi e adulti, in cui veniva eliminata di colpo l’espressione del gene APC,

la via di Wnt non funziona bene e si assiste a una profonda trasformazione dell’intestino. Dato che

APC non è prodotta, anche in assenza di Wnt si ha la trascrizione dei geni bersaglio di Wnt (come

nel caso in cui APC è mutata). Nell’intestino i villi si riducono, mentre si formano delle regioni simili

a cripte di dimensioni sempre maggiori e il numero di cellule differenziate, oltre che ai villi, si

riducono.

Vennero fatti altri esperimenti in cui, grazie a un farmaco inibitore di Wnt stesso, la segnalazione di

Wnt viene bloccata. In questo caso, l’intestino vede una situazione peculiare: mentre le cellule

caliciformi enteroendocrine, le cellule di Paneth sono praticamente assenti, le cellule differenziate

dell’intestino sono per lo più enterociti.

Se la via di segnalazione di Wnt non viene bloccata di colpo ma è sempre bloccata grazie a un

inibitore diffusibile di Wnt, troviamo un intestino con cripte praticamente assenti e un unico tipo

cellulare differenziato, gli enterociti, mentre sono assenti le altre tipologie cellulari che derivano

dalla staminale (quelle che hanno un fenotipo che secerne). Quando si va a tenere sempre bloccata

la via di Wnt, questi dati che vedono alterata la produzione differenziata nell’intestino hanno

permesso di comprendere come questa via di segnalazione sia necessaria per mantenere lo stato

proliferativo, ma anche per conferire il commissionamento per il differenziamento verso tutti e

quattro i tipi cellulari presenti nell’intestino e che derivano dalla staminale intestinale.

- VIA DI SEGNALAZIONE DI NOTCH

La via di Wnt β-catenina va a modulare anche l’espressione di componenti della via di segnalazione

di Notch, un’altra importante via di segnalazione per il differenziamento cellulare. Nel caso delle

cellule staminali intestinali, è proprio la via di Notch a controllare il differenziamento a enterociti o

verso cellule di Paneth, enteroendocrine e caliciformi; inoltre, il fatto che la via di Wnt controlli

anche la via di Notch, ci permette di comprendere come la via di segnalazione di Wnt sia a monte,

quindi necessaria non soltanto a mantenere lo stato proliferativo del compartimento staminale

intestinale, ma anche nel commissionare i progenitori di cellule a differenziarsi correttamente verso

tutti e quattro i tipi cellulari.

Questa via di segnalazione è molto interessante: è una delle vie più usate durante lo sviluppo

animale, è stata scoperta in Drosophila melanogaster. Notch è un recettore che si trova esposto

sulla m