Appunti seconda parte del corso di Fondamenti di ingegneria ambientale

LA SCOPERTA DELLA STRUTTURA DEL DNA

La scoperta del DNA risale alla metà del XIX secolo, ma il suo ruolo come materiale genetico fu chiarito solo nel XX

secolo.

Friedrich Miescher, un biologo svizzero, isolò per la prima volta il DNA dai globuli bianchi nel 1869. Tuttavia, la sua

importanza rimase sconosciuta.

James Watson e Francis Crick sono accreditati per aver proposto nel 1953 la struttura a doppia elica del DNA, basandosi

sui dati di cristallografia a raggi X di Rosalind Franklin e Maurice Wilkins.

La scoperta della struttura valse a Watson, Crick e Wilkins il premio Nobel per la Fisiologia e la medicina nel 1962.

DOGMA CENTRALE DELLA BIOLOGIA MOLECOLARE DNA archivio che contiene l’informazione.

REPLICAZIONE RNA vettore dell’informazione, ma spesso possono avere

funzioni aggiuntive (ad esempio rRNA, tRNA, ribozimi).

TRASCRIZIONE Proteine sono i moduli funzionali.

TRADUZIONE

REPLICAZIONE

La replicazione( o duplicazione) è il processo molecolare

che porta alla formazione di nuove molecole di DNA e al

trasferimento del materiale genetico durante la divisione

cellulare.

L’enzima fondamentale della replicazione è la DNA

polimerasi, che si associa a sequenze specifiche chiamate

origini di replicazione

TRASCRIZIONE

Processo di conversione di specifiche regioni del DNA( i geni) in RNA.

La trascrizione avviene nel nucleo per gli eucarioti e nel nucleoide per i procarioti.

FASI:

1) Inizio: l’RNA polimerasi si lega al promotore del gene.

2) Allungamento: l’RNA polimerasi si sposta lungo il filamento di DNA sintetizzando una

molecola di RNA

3) Terminazione: in corrispondenza dei siti di terminazione, la trascrizione si interrompe,

la polimerasi si stacca e il trascritto viene liberato nel citoplasma.

TRADUZIONE

La traduzione è il processo in cui l’RNA guida la sintesi delle proteine.

L’informazione che nell’mRNA è codificata da soli 4 nucleotidi deve generare 20 amminoacidi diversi.

Consideriamo una sequenza di RNA: 5’-AUGAUCAGAAUCG-3’

Se leggiamo l’RNA:

• 1 base alla volta (A,U,G,A,U,C,..) possiamo codificare solo 4 amminoacidi

• 2 basi alla volta (AU,GA,UC,AG,..) 4^2combinazioni =16 amminoacidi, non abbastanza!

• 3 basi alla volta (AUG,AUC,AGA,..) 4^3 combinazioni=64 amminoacidi, abbastanza combinazioni per 20

amminoacidi diversi.

La cellula ha un sistema per interpretare il codice genetico. La regione codificante è letta di tre in tre basi: ogni tripletta

di basi è chiamata codone.

Tutti gli organismi hanno lo stesso codice genetico (ovvero, a uno stesso codone corrisponde lo stesso amminoacido),

che è quindi definito universale.

COME LEGGERE IL CODICE GENETICO?

Le quattro lettere nella colonna a sinistra indicano la prima base del

codone, le lettere in alto indicano la seconda base. Nella tabella, di

fianco a ogni codone è indicato l’amminoacido corrispondente.

Molti amminoacidi sono codificati da più di un codone, ovvero il codice

genetico è degenere.

Tre codoni hanno la funzione di codificare lo STOP,cioè la fine della

proteina. Il codone ATG codifica per la metionina, ma indica anche

l’inizio della regione codificante ( il punto da cui iniziare a leggere di tre

in tre).

Conoscendo la sequenza di mRNA, si può ottenere la sequenza di

amminoacidi codificata.

AMMINOACIDI

Sono i monomeri delle proteine. Hanno una struttura costante e una catena laterale variabile. La catena laterale è quella

che conferisce a ciascun amminoacido proprietà fisico-chimiche distinte.

PROTEINE ED ENZIMI

Le proteine sono grandi e complesse molecole, composte da amminoacidi concatenati.

Svolgono una vasta gamma di funzioni, tra cui il supporto strutturale ( unghie, capelli..), trasporto di molecole nella cellula,

difesa dai patogeni(anticorpi) e catalisi enzimatica di reazioni.

Gli enzimi sono proteine specializzate per facilitare determinate reazioni chimiche ad altissima specificità.

Gli enzimi funzionano legandosi a molecole specifiche (substrati) e stabilizzando lo stato di transizione (configurazione

instabile delle molecole durante la reazione), facilitando così il verificarsi della reazione.

Tutti gli enzimi sono proteine, non tutte le proteine sono enzimi.

L’insieme di enzimi codificati da una cellula ne determinano le proprietà metaboliche: quali molecole possono essere usati

come fonte di energia, ad esempio. FONDAMENTI DI MICROBIOLOGIA

La microbiologia è lo studio degli esseri viventi di dimensioni troppo piccole per essere osservate senza ingrandimento.

I microbi ,o microorganismi, sono organismi microscopici, di dimensioni inferiori a 0,1 mm, caratterizzati da attività tipiche dei

sistemi biologici.

I microorganismi sono in relazione con diversi aspetti di interesse:

• sono parenti in tutti gli ambienti (inclusi quelli estremi)

• sono coinvolti in numerosi processi biologici (microbiota e digestione, cibi biogeochimici)

• hanno rilevanza a livello industriale (fermentazioni, digestione anaerobica,…)

• pochi sono patogeni.

ECOLOGIA MICROBICA

BIODIVERSITÀ: isolare, identificare e quantificare i microorganismi.

Con quali tecniche?

• Tecniche morfologiche (che aspetto hanno?)

• Tecniche colturali (con che substrati crescono?)

• Tecniche molecolari (con chi sono imparentati ,filogenesi)

ATTIVITÀ MICROBICA : misurare cosa fanno i microorganismi.

Con quali tecniche?

• Tecniche biochimiche e fisiologiche ( quali sono le proprietà fisiologiche dei microorganismi?)

• Tecniche molecolari (cosa possono fare?,per quali funzioni codificano?)

TIPOLOGIE DI RELAZIONI

In natura, i microorganismi si trovano quasi sempre in compresenza con altri organismi, in relazioni di tipo microorganismo-

ospite oppure in comunità microbiche.

Il termine simbiosi descrive una relazione intima tra organismi di specie diverse, che vivono nello stesso ambiente e

interagiscono tra loro.

Ci sono diversi tipi di relazioni simbiotiche:

• Mutualismo: entrambi gli organismi beneficiano della simbiosi

• Commensalismo: un organismo è avvantaggiato dall’interazione, l’altro non ne è né avvantaggiato né svantaggiato

• Parassitismo: un organismo vive a spese dell’altro.

COME POSSIAMO INDAGARE I MICROORGANISMI? OSSERVAZIONE INDIRETTA

OSSERVAZIONE DIRETTA • Sequenziamento Metagenomica

• Curve di crescita Caratterizzazione fisiologica Metatrascrittomica

• Microscopia Osservazione morfologica

Tecniche di staining

• Isolamenti

CRESCITA MICROBICA

In microbiologia la crescita é definita come un aumento del numero di cellule.

Nei procarioti, una cellula si divide in due cellule figlie identiche( fissione binaria).

Il tempo di generazione ( chiamato anche tempo di duplicazione o tasso di

crescita) dipende da fattori quali la temperatura, nutrienti,substrati,corredo

genetico.

Alcuni parametri che influenzano la crescita:

• temperatura

• pH

• concentrazione di ossigeno

• nutrienti essenziali :N,P,S

Ogni specie microbica si è evoluta in

relazione a un determinato ecosistema.

Crescerà quindi meglio in corrispondenza di

temperatura, pH, salinità, etc. ai quali si è

adattata. Se ci sono scostamenti dalle

condizioni ottimali, questi determineranno

un tasso di crescita inferiore.

LE FASI DI CRESCITA

1) Fase di lag: i microorganismi si adattano alle condizioni

di crescita.

2) Fase esponenziale: non ci sono limitazioni alla

crescita.

3) Fase stazionaria: limitazioni dei nutrienti o l’accumulo di

prodotti di scarto inibiscono la crescita dei microorganismi,

ma il metabolismo potrebbe continuare.

4) Fase di morte: le cellule muoiono e si lisano.

TECNICHE DI MONITORAGGIO DELLA CRESCITA

1) Spread plating : isolamento e quantificazione di cellule capaci di formare Vantaggi: metodi semplici e rapidi

colonie su mezzi solidi (agar) che possono arricchire o selezionare gruppi Svantaggi: i microorganismi devono

ristretti si specie microbiche. essere in grado di crescere nelle

2) Streak plating: isolamento di singole colonie batteriche. condizioni ambientali in cui si opera.

3) Camere di conta e torbidità: quantificazione delle cellule in crescita in un

mezzo liquido.

Diluizione e isolamento di batteri con ansa

per inoculazioni o ago su piastre Petri.

Camera di conteggio: conteggio delle cellule totali al microscopio ottico

Vantaggi: procedura più veloce della cultura di Petri

Svantaggi : - impossibile distinguere cellule vive e morte

-le cellule piccole sono molto difficili da vedere (batteri)

-se le cellule si muovono nel campione, devono essere

fissate

Torbidità: misura allo spettrofotometro della luce che

attraversa una sospensione di cellule (densità ottica, OD)

Lo spettrofotometro è in grado di selezionare dalla luce visibile

lunghezze d’onda specifiche.

La luce alla lunghezza d’onda filtrata attraversa il campione

(sospensione batterica) e colpisce un detector.

Più la coltura è torbida, meno luce riuscirà ad attraversare il

campione.

TIPOLOGIE DI MEZZI DI CRESCITA

Mezzi sintetici (o definiti): mezzi di crescita relativamente semplici di cui tutte le componenti sono note.

Mezzi complessi: la composizione dei mezzi non è completamente caratterizzata. Spesso sono ottenuti da materiali organici

poco costosi come rifiuti dei macelli, soia, scarti di lieviti coinvolti in processi di birrificazione, sangue animale, etc….

Mezzi selettivi: favoriscono la crescita solo di alcuni organismi sulla base di una o più caratteristiche fisiologiche.

Esempio: i sali biliari inibiscono la crescita della maggior parte dei batteri Gram-positivi e di alcuni Gram-negativi, ma non

inibiscono i batteri enterici, che si sono adattati alla vita in presenza di questi sali nel tratto digerente animale.

Mezzi differenziali: permettono di discriminare i microorganismi o qualche loro caratteristica fisiologica.

Esempio: il MacConkey agar contiene un indicatore colorimetrico di pH che vira al rosso in ambienti acidi. I batteri in grado di

fermentare uno zucchero contenuto nel mezzo (es. glucosio) accumuleranno sulla piastra prodotti di scarto, facendo sì che le

relative colonie siano rosse. Al contrario, i batteri che non fermentano quello zucchero cresceranno senza influenzare il pH,

quindi le colonie resteranno bianche.

ESEMPI

Microorganismi sconosciuti (es.campioni ambientali).

• Coltura su piastre Petri con mezzi complessi

• Caratterizzazione delle colonie su base morfologica

Svantaggio: La conta cellulare ottenuta con un mezzo solo

darà sempre una forte

sottostima del numero reale di cellule (”great plate count

anomaly”)

Microorganismi ben caratterizzati (es.