Appunti di Genetica molecolare con esercizi svolti

MUTAZIONI PER SOSTITUZIONE DI BASE

Tali mutazioni riguardano l’alterazione di un singolo nucleotide di DNA

TRANSIZIONE: una purina viene sostituita da una purina diversa o una pirimidina viene

sostituita da una pirimidina diversa. (Più comune rispetto alla trasversione).

TRASVERSIONE: una purina è sostituita da una pirimidina o viceversa.

MUTAZIONI PIU’ FREQUENTI: MUTAZIONI DI FRAMESHIFT (Cornice di lettura)

DELEZIONE: durante la replicazione del DNA si può perdere un segmento di esso

INSERZIONE: si verifica quando durante la replicazione si crea una forcina sul

filamento neosintetizzato, il quale farà sì che il prossimo filamento stampo contenga

delle basi in più. In questo modo il codice di lettura si sposta e gli amminoacidi

sintetizzati saranno diversi poiché cambieranno le triplette prese in considerazione.

Le basi azotate che formano il DNA possono dare reazioni di TAUTOMERIA CHETO-

ENOLICA o AMMINICA-IMMINICA. Le tautomerie consistono nella transizione degli atomi

di idrogeno per formare un intermedio enolico. Ciò causa un vacillamento nel legame

tra due basi consecutive, producendo errori durante l’appaiamento delle nuove basi

sintetizzate dalla DNA polimerasi.

SINDROME DELL’X FRAGILE (Ritardo mentale)

Il cromosoma X delle persone affette da tale sindrome possiede delle basi aggiuntive.

L’allele in quel punto contiene infatti circa centinaia o migliaia di copie della tripletta di

basi CGG. Mutazione a penetranza incompleta.

MODIFICHE CHIMICHE SPONTANEE

DEPURINAZIONE: Un nucleotide perde la sua base purinica dando luogo ad un sito

apurinico che non può fungere da stampo durante la replicazione.

DEAMMINAZIONE: Consiste nella perdita di un gruppo amminico NH . Se una base

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perde un gruppo amminico le sue proprietà di appaiamento sono alterate. Ad esempio,

con una deamminazione, la citosina viene riconvertita in uracile.

MUTAGENI

I mutageni sono agenti ambientali, come sostanze chimiche o radiazioni, che alterano

il DNA. I raggi X ad esempio sono capaci di rompere lo scheletro del DNA, mentre le

radiazioni ultraviolette causano dimeri di timina (i quali, non potendo appaiarsi,

bloccano la replicazione).

DROSOPHILA: sono state osservate numerose mutazioni in Drosophila M. causate

proprio dall’esposizione ai raggi X.

DOGMA CENTRALE: DAL DNA VIENE TRASCRITTO UN SEGMENTO DI RNA CHE VERRA’

POI TRADOTTO IN PROTEINA

Ad oggi sappiamo che vi sono diverse eccezioni che non seguono tale dogma. Le

eccezioni sono costituite da: RNA ribosomiale, t RNA, micro-RNA, long RNA.

Francis CRICK e Sydney BRENNER 1957: Come viene letto il codice genetico?

Per capire le modalità di lettura del codice genetico Crick e Brenner riprendono gli

esperimenti sul fago T4 intrapresi da Benzer sull’analisi dell’effetto del mutante r2-

con effetto pleiotropico. Essendo già a conoscenza del numero delle basi azotate e del

totale degli amminoacidi che compongono le proteine, gli scienziati ipotizzano che il

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codice genetico venga letto per triplette, formando 4 triplette disponibili per i 20

amminoacidi esistenti.

FASI DELL’ESPERIMENTO:

1) Viene aggiunto un reagente che induceva un alto numero di mutazioni – agente

mutageno -: la PROFLAVINA. Quest’ultima induceva un alto numero di mutazioni

in forward (cioè mutazioni che andavano dal wild type al mutated gene) e

riduceva quelle in reverse.

Wild type (wt) -> proflavina -> mutanti che non sopravvivevano in K12

2) Dopo aver isolato i mutanti, viene Tali osservazioni dimostrano che

nuovamente aggiunta proflavina ad essi: la lettura avviene

si notava che venivano prodotti necessariamente per TRIPLETTE di

retromutanti (cioè fagi con fenotipo wild nucleotidi.

type).

Mutanti -> proflavina -> retromutanti o revertenti, che sopravvivevano nel ceppo non

permissivo.

Tali retromutanti furono chiamati PSEUDOSELVATICI: il numero di queste placche era

tuttavia troppo elevato. Ciò fece intuire a Crick e Brenner che non si trattasse di wild

type “originali” quanto piuttosto di doppi mutanti, wt*.

3) Vengono incrociati i revertenti wt* con selvatici wt: la progenie viene poi inserita

in B e in K12. Si notano così mutanti r2 capaci di crescere soltanto nel ceppo

permissivo B.

Crick e Brenner intuiscono che un incrocio tra wild type (quindi PRIVO di mutazioni) e

un wt* (con DUE mutazioni FC0 e FC7) originava 2 classi di PARENTALI (wt e wt*) e due

classi di RICOMBINANTI r2 (dove appunto era avvenuto CROSSING OVER).

Questa intuizione consente di poter affermare che il codice genetico viene letto in una

sola direzione e non ha segni di interpunzione. Crick e Brenner, infatti, avevano già

provato che la proflavina fosse un AGENTE INTERCALANTE: si poneva nelle basi

azotate del DNA comportando una DELEZIONE o una INSERZIONE. I due scienziati non

sapevano quale tra FC0 e FC7 fosse la delezione e quale l’inserzione, ma potevano

affermare con certezza che le tue mutazioni COMPLEMENTAVANO tra loro originando

un fenotipo wild type. Un’inserzione può annullarsi con una delezione se e solo se il

codice viene letto in maniera unidirezionale senza punti di interpunzione.

Gli esperimenti di Benzer sono stati quindi fondamentali per giungere a tale

assunzione: le delezioni e le inserzioni sono mutazioni di FRAME SHIFT che riguardano

la soppressione INTRAGENICA.

Scoprendo altre tipologie di mutanti, Crick e Brenner capiscono che il codice genetico

viene letto a TRIPLETTE (proprio come avevano già precedentemente ipotizzato).

Scoprono due classi di mutazioni diverse:

FC0, FC2, FC4

FC3, FC5, FC7

TRE mutazioni dello stesso tipo davano un WILD TYPE.

DUE mutazioni DIVERSE davano un WILD TYPE.

DUE mutazioni dello stesso tipo davano MUTANTE.

La successiva scoperta della decifrazione del codice avverrà più tardi, nel 1964, ad

opera di NIRENBERG e MATTHAEI. Gli scienziati, dopo aver accuratamente analizzato

le proteine, riescono a determinare le triplette corrispondenti agli amminoacidi. I due

ricercatori prepararono un mRNA artificiale in cui tutte le basi erano costituite

dall’uracile (un mRNA sintetico detto, appunto, poli U). Aggiungendo un poli U in una

provetta contenente gli ingredienti necessari alla sintesi proteica, si formò una catena

polipeptidica tutta composta da un solo tipo di amminoacido: la fenilalanina. Dunque

un poli U codificava la fenilalanina; di conseguenza, UUU era la parola in codice – il

codone – per specificare la fenilalanina. Sulla scia di questo successo, Nirenberg e

Matthaei dimostrarono ben presto che CCC codifica la prolina e AAA codifica la lisina

(poli G presentava qualche problema dal punto di vista chimico e inizialmente non fu

preso in esame). UUU, CCC e AAA erano tre codoni fra i più facili; per venire a capo

degli altri fu necessario modificare l’approccio sperimentale. Proseguendo i suoi

esperimenti con Leder, Nirenberg arriva infine a stipulare TUTTI i possibili codoni a cui

corrispondono gli amminoacidi (rispettivamente 61 e 20). I due scienziati utilizzarono

molecole di tRNA carichi con amminoacidi marcati radioattivamente, miniRNA e

ribosomi. Utilizzando un filtro, essi capiscono che quando il tRNA è carico con

l'amminoacido corrispondente alla tripletta, si forma un complesso tra ribosoma,

mRNA e tRNA che non passa attraverso il filtro. La radioattività è dunque visibile nel

filtro. Quando invece il tRNA è carico con un amminoacido non corrispondente alla

tripletta, non si forma un complesso, I ribosoma viene fermato dal filtro mentre il tRNA

e I'mRNA no. La radioattività non è visibile nel filtro. Interpretazione: Questo

esperimento ha permesso di capire la relazione tra molte triplette e amminoacidi,

risolvendo anche le ambiguità del codice genetico. Il codice genetico NON E’

AMBIGUO.

REGOLAZIONE DELL’ESPRESSIONE GENICA

Processo di differenziamento cellulare: le cellule, dopo le prime settimane di sviluppo

dello zigote, iniziano a differenziarsi nel fenotipo a causa della diversa ESPRESSIONE

GENICA. Tuttavia, ci sarà comunque una certa quantità di geni che potranno essere

controllati (e devono essere controllati) anche dopo il differenziamento. Si parla infatti

di due tipi di controllo:

CONTROLLO TEMPORALE: diverse fasi del ciclo cellulare richiedono diverse proteine

(in quantità) e di conseguenza attivazione di diversi geni

CONTROLLO SPAZIALE: la cellula riesce a reagire ai cambiamenti provenienti

dall’ambiente esterno grazie a delle modifiche interne (nella regolazione dei geni).

JACOB e MONOD (1965) conducono esperimenti sull’E. Coli per capire come avviene

il controllo dell’espressione dei geni all’interno delle cellule batteriche.

I batteri di E. Coli riuscivano a adattarsi sia crescendo in un terreno a base di

GLUCOSIO che in uno a base di LATTOSIO, tuttavia, le concentrazioni della β-

galattosidasi (della permeasi e della transacetilasi) erano profondamente diverse nel

tempo (a seconda dei terreni). Tale enzima è fondamentale per degradare le

biomolecole di lattosio in allolattosio prima, e glucosio e galattosio dopo. (Ciò accade

poiché i batteri sono capaci di reagire agli stimoli esterni e rispondere con una diversa

regolazione genica in base all’esigenza proteica: in un terreno a base di glucosio, gli E.

Coli NON hanno bisogno di un’alta concentrazione di β-galattosidasi).

Osservando questa differenza di concentrazione, decidono di isolare dei MUTANTI con

difetti enzimatici, non capaci di crescere in un terreno di LATTOSIO.

Riescono a mappare la sequenza dei geni in E. Coli e trovano: LAC Z, LAC Y, LAC A.

Capiscono che le mutazioni che mappano in lac Z aboliscono anche l’attività della

permeasi (lacY) e della transacetilasi (Lac A). Le mutazioni che mappano in lac Y

aboliscono anche l’attività della transacetilasi (Lac A) ma NON della beta galattosidasi

(Lac Z).

Ciò significa che esistono tre tipi di mutazioni diverse:

-Mutazione NON SENSO in lac Z: beta-Galattosidasi non funzionale, non si producono

né Permeasi né Transacetilasi

-Mutazione non senso in lac Y: Galattosidasi funzionale, Permeasi non funzionale, non

si produce Transacetilasi

-Mutazione non senso in lac A: Galattosidasi e Permeasi funzionali, Transacetilasi non

funzionale.

Questi mutanti appartengono alla classe di mutanti POLARI.

Tali tre geni – seppur intervallati da codoni di start e di stop tra loro - vengono trascritti

insieme, in un unico RNA che viene detto RNA POLICISTRONICO (i batteri vengono

definiti “parsimoniosi”).

Gli scienziati formulano così la definizione di OPERONE, presente solo nelle cellule

procariotiche: esso è un gruppo di geni strutturali unito a sequenze che controllano la

trascrizione. È una singola unità