Appunti di Biochimica per medicina e chirurgia

Modificazioni post-traduzionali (lezione 9 marzo)

Le proteine vengono sintetizzate nei ribosomi, ma per diventare biologicamnete attive

spesso necessitano di modificazioni post-traduzionali; ne sono esempi la proteolisi (rottura

di legami), la glicosilazione (aggiunta di residui zuccherini), la fosforilazione (aggiunta di

gruppi fosfato, azione reversibile), ecc. ecc.

Eteropolisaccaridi

Sono polisaccaridi in cui si ripetono unità differenti fra loro (unità derivate dai carboidrati

classici). Ne sono esempi i glicosamminoglicani (GAG) polisaccaridi accomunati dalla

presenza di una carica negativa, sono infatti molecole polianioniche estremamente idrofile e

idrosolubili. L’eparina ad esempio è un GAG ed è usata come anti-coagulante (si lega

all’antitrombina terza, la quale inibisce la trombina, motivo per cui il sangue non coagula).

Gli eteropolisaccaridi vengono anche detti mucopolisaccaridi acidi, perché spesso

contengono derivati di acidi di monosaccaridi. Deve esserci ricambio (equilibrio tra sintesi e

degradazione); se la fase degradativa (che avviene attraverso enzimi idrolitici) è alterata si

parla di mucopolisaccaridosi: un insieme di patologie ereditarie in cui i mucopolisaccaridi

non vengono correttamente degradati. Ne è un esempio la Sindrome di Hurler (o

gargoilismo), dovuta a un deficit genetico recessivo di alfa-iduronidasi lisosomiale, che

provoca nanismo disarmonico, ritardo mentale, epatosplenomegalia, alterazioni cardiache

(valvulopatie), accumulo di mucopolisaccaridi nei tessuti facciali.

Glicoconiugati

Sono un gruppo di molecole con frazione glicidica (carboidrati) e frazione non glicidica

(proteine e lipidi). Si trovano spesso sulla superficie cellulare a costituire il glicocalice.

Quando i carboidrati si uniscono con i lipidi di membrana formano i glicolipidi.

Quando invece si uniscono con le proteine formano le glicoproteine o i proteoglicani. Le

glicoproteine contengono più proteine che carboidrati, mentre i proteoglicani contengono

una maggiore componente glicidica (composta da GAG) e una minore componente

polipeptidica. Questi ultimi si trovano nella matrice extracellulare.

Le proteine vengono glicosilate perché così facendo si aumenta la biodiversità; infatti la

diversità individuale è garantita dalla presenza di catene zuccherine differenti (diverse

composizioni, diverse ramificazioni,…). Inoltre grazie alla glicosilazione delle proteine si ha

un aumento dell’idrofilia e della solubilità delle molecole glicosilate, un aumento della

distensione delle molecole (dovuta all’ampia presenza di cariche negative), una migliore

regolazione delle attività (la glicosilazione è reversibile con singoli residui di monosaccaride)

e un controllo della qualità delle proteine (segnalazione di misfolding, con indirizzamento al

proteasoma).

Nei glicoconiugati si possono formare due tipi di legame fra glicidi e polipeptidi:

legame O-glicosidico: si forma in fase post-traduzionale, normalmente all’interno

• dell’apparato di Golgi. Il glicide si somma a serina o treonina, attraverso ponte a

ossigeno. Nelle glicoproteine non sono state individuate sequenze consenso (quindi

non si hanno particolari sequenze di riconoscimento) e tendono a formarsi catene

oligosaccaridiche di dimensioni contenute. Nei proteoglicani la porzione

oligosaccaridica è rappresentata dai GAG, che si trovano in quantità maggiore

rispetto alle proteine. I GAG si legano a residui di serina in particolari sequenze

consenso.

legame N-glicosidico: si forma in fase co-traduzionale, nel reticolo endoplasmatico,

• ed è caratteristico delle glicoproteine. I residui saccaridici vengono legati a residui di

asparagina nella sequenza N-X-S/T, dove X è un amminoacido qualsiasi (no prolina).

Meccanismo della N-glicosilazione:

Si utilizza un alcol di natura terpenica ad alto peso molecolare, che si comporta come

trasportatore di catene oligosaccaridiche, chiamato dolicolo.

Il dolicolo è inizialmente in forma attivata sotto forma di dolicolofosfato (dolicolo-P). I residui

saccaridi vengono caricati sul dolicolo attraverso reazioni enzimatiche specifiche, a cui

partecipa una forma attivata dello zucchero (i legami richiedono energia, quindi gli zuccheri

si legano a un nucleotide).

1.Due residui di N-acetillucosammina (NAG) sono legati al dolicolo sul versante citosolico

della membrana del reticolo endoplasmatico.

2.Si legano 5 residui di mannosio (MAN) sul dolicolo-PP-NAG-NAG. Si crea una catena

oligosaccaridica ramificata.

3.Il dolicolo glicosilato viene traslocato

sul versante endoluminale della

membrana del reticolo endoplasmatico.

4/6.Vengono aggiunti altri 4 residui di

mannosio, provenienti da singole

molecole di dolicolo-P-MAN sul versante

endoluminale; si forma così una catena

oligosaccaridi multiramificata ricca di

mannosio.

7/9. Con un meccanismo analogo la

catena si arricchisce di tre residui di

glucosio, quindi si forma una catena

oligosaccaridica formata da 14 residui di

zucchero.

10. La catena oligosaccaridica viene trasferita dal dolicolo su un residuo di asparagina della

proteina nascente in fase di sintesi, con formazione del legame N-glicosidico.

11. Il dolicolo libero viene traslocato in senso opposto sulla membrana ed è libero di dare

inizio ad un nuovo ciclo di glicosilazione.

La catena oligosaccaridica appena formata

viene rimaneggiata nell’apparato di Golgi, fino

ad ottenere un pentasaccaride comune a cui

vengono aggiunti altri residui con varie

modalità. In questo modo si ottiene grande

eterogeneità nella catena oligosaccaridica. Il

nucleo pentasaccaridico è quindi comune fra

tutti gli oligosaccaridi.

Glicobiologia

La glicobiologia è lo studio della struttura e funzione dei glicoconiugati. Si occupa di studiare

come le cellule usano gli specifici oligosaccaridi per codificare informazioni su:

targeting intracellulare delle proteine

• interazioni cellula-cellula

• differenziazione cellulare e sviluppo tissutale

• segnalazione extracellulare

•

Il riconoscimento degli oligosaccaridi da parte di proteine leganti zuccheri (chiamate lectine)

deriva da un’interazione proteina-ligando estremamente specifica. Le lectine infatti legano

specificatamente la componente glicidica di glicoproteine e glicolipidi sulla superficie delle

membrane (a). Le lectine mediano processi tra virus e cellule infettate (b), legami di tossine

batteriche (c), mediano il riconoscimento dei batteri che aderiscono e colonizzano le cellule

animali (d) , il legame tra i globuli bianchi e le cellule endoteliali infettate (e) e il trasferimento

degli enzimi dal Golgi ai lisosomi (f).

Le selectine sono una famiglia di lectine plasmatiche che mediano il riconoscimento e

l’adesione cellula-cellula in un’ampia gamma di processi cellulari.

Proteoglicani

Sono proteine altamente glicosilate, con un’ampia componente glicidica (GAG).

Hanno funzione di organizzatori tissutali, adesione intercellulare, regolazione della

coagulazione del sangue, attivazione di fattori di crescita e smaltimento dei lipidi dal sangue.

Possono essere frammentati utilizzando alcuni enzimi, dopodichè la porzione extracellulare

viene rilasciata. Hanno dimensioni varie; per esempio l’aggregano (nucleo proteico) si lega

con l’ialurinano per creare un aggregato sopramolecolare molto grande. Sono molto

importanti per i processi di segnalazione perché interagiscono con il collageno, che a sua

volta interagisce con la fibronectina (recettori formati da integrina), connessa al

citoscheletro, precisamente ai filamenti di actina.

FOSFORILAZIONE

La fosforilazione di una proteina consiste nel trasferimento di un gruppo fosfato dall’ATP alla

proteina attraverso una reazione catalizzata da un enzima, chiamato proteina chinasi.

La fosforilazione può avvenire su residui di serina e treonina (utilizzano proteina chinasi, PK),

oppure tirosina (tirosina chinasi, PTK).

Questo processo è reversibile: infatti il fosfato può essere distaccato a un altro enzima

chiamato proteina fosfatasi, PP, (o tirosina fosfatasi, PTP).

La proteina in forma fosforilata possiede cariche negative dei gruppi -PO , che determinano

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un cambiamento conformazionale rispetto alla forma non fosforilata. Alla diversa forma

della proteina corrisponde una diversa attività della proteina.

Le fosforilazioni possono anche avere un significato diverso rispetto a quello regolatorio se

avvengono su proteine già modificate. Ad esempio, la fosforilazione di un residuo di

mannosio a mannosio 6-fosfato presente su una glicoproteina in transito nell’apparato di

Golgi indirizza la proteina modificata dal Golgi al lisosoma. Lo smistamento delle proteine

all’interno della cellula è molto importante e si basa molto spesso su modificazioni post-

traduzionali specifiche.

ANCORE LIPIDICHE

Le ancore lipidiche hanno funzione di ancoraggio della proteina alla membrana e

modulazione dell’attività proteica, inoltre è un processo reversibile.

Le ancore lipidiche si formano attraverso vari meccanismi:

1. miristilazione: l’acido miristico è un acido grasso saturo a 14 atomi di carbonio, viene

aggiunto al gruppo amminico N-terminale (solo proteine che possiedono una glicina

possono ricevere un miristile) di una proteina durante la sua sintesi nel ribosoma.

Tutti i membri della famiglia Src di proteina tirosina chinasi citoplasmatiche sono

miristilate. Non hanno un collegamento alla membrana molto forte.

2. palmitilazione: per la maggior parte delle Src chinasi la seconda modificazione

lipidica consiste nel collegamento di acido palmitico, un acido grasso saturo

composto da 16 atomi di carbonio, ad una catena laterale di cisteina della proteina.

Questa modificazione è reversibile, avviene in risposta ad un segnale extracellulare, e

aiuta a reclutare la chinasi verso la membrana plasmatica. Quando la via di

segnalazione è spenta l’acido palmitico viene rimosso, permettendo alla chinasi di

ritornare in soluzione nel citosol.

3. prenilazione: i lipidi isoprenoidi sono il farnesile (15

carboni) e il geranil-geranile (20 carboni), e si attaccano

alle cisteine in zona C-terminale (attraverso un legame

tioetere). Quando è presente un motivo CAAX il

Cterm

gruppo farnesile è legato alla catena laterale della

cisteina e i tre residui C-term sono rimossi. Dopo viene

metilato il carbossile.

4. ancora glicosil-fosfatidilinositolo

(GPI): meccanismo utilizzato da

molte proteine della faccia

extracellulare della membrana

che, per rimanere in stretto

legame con la membrana

stessa, vengono addizionate di

un “picchetto” di ancoraggio

lipofilo. Le proteine legate a GPI

possono essere rilasciate dalla

superficie esterna delle cellule

dalle fosfolipasi.

TAGLI PROTEOLITICI

Sono importanti per la biodiversità (rimozione della

metionina N-terminale),per il targeting delle proteine

(alcune proteine sono indirizzate a destinazione

mediante un taglio proteolitico che rimuove un

peptide segnale in posizione N-terminale) e

rappresentano un importante meccanismo di

attivazione (alcune proteine sono sintetizzate in

forma inattiva e vengono successivamente attivate

per taglio proteolitico).

Un esempio di molecola attivata attraverso taglio

proteolitico è l’insulina. Essa è infatti prodotta dalle

cellule beta del pancreas, sotto forma di

preproinsulina. La sequenza segnale che setina la

proteina alla secrezione viene rimossa da un primo

taglio proteolitico per formare proinsulina,

conservata poi nei granuli di secrezione.

Sotto stimolo di alte concentrazioni ematiche di

glucosio (glicemia) un secondo taglio proteolitico

rimuove il peptide C producendo l’insulina matura.

Il peptide segnale delle preproteine varia da 13 a 36 amminoacidi di lunghezza:

1. uno o più amminoacidi basici nella zona N-terminale

2. una sequenza di 10-15 amminoacidi idrofobi

3. una breve sequenza di amminoacidi di piccole dimensioni (Alanina, serina, glicina) in

prossimità del sito di scissione

meccanismo alla base dei tagli proteolitici:

1. inizio della sintesi proteica

2. comparsa della sequenza segnale

3. legame sequenza segnale-SRP (arresto della sintesi proteica)

4. SRP guida il ribosoma verso la membrana del reticolo, legandosi a un recettore

specifico

5. SRP si distacca

6. ripresa della sintesi proteica

7. distacco del peptide segnale

8. liberazione proteina nel lume del reticolo

9. distacco del ribosoma

ACETILAZIONE DEGLI ISTONI

I gruppi acetilici (CH COO ) legati covalentemente ai residui di lisina:

-

3

neutralizzano le cariche positive

• eliminano le interazioni ioniche col DNA

• diminuiscono il livello di condensazione della cromatina

• associati con l’attivazione della trascrizione

•

L’acetilazione degli istoni è un processo reversibile che influenza la trascrizione genica.

METILAZIONE DEGLI ISTONI

La metilazione su residui di arginina delle code N-

terminali degli istoni è un processo reversibile che

influenza la trascrizione genica. CARBOSSILAZIONE

La carbossilazione dei residui di glutammato sul

carbonio gamma avviene in alcune proteine coinvolte

nella coagulazione del sangue.

La presenza di due gruppi carbossile favorisce il legame

di Ca .

2+

Questa reazione è catalizzata dalla gamma-

glutammato carbossilasi e richiede vitamina K.

UBIQUITINAZIONE

L’ubiquitina è una piccola proteina di 76 amminoacidi presente in tutte le cellule

eucariotiche. Presenta un residuo di glicina all’estremità C-terminale e due residui di lisina

molto importanti. L’ubiquitina è coinvolta nel processo di proteolisi citosolica.

Processo di ubiquitinazione:

E1: enzima attivatore dell’ubiquitina

si lega al C-terminale dell’ubiquitina mediante

un gruppo -SH della cisteina

E2: enzima di coniugazione dell’ubiquitina

lega l’ubiquitina su un gruppo -SH

E3: ubiquitina ligasi

lega E2 e la proteina bersaglio

L’enzima E3 riconosce proteine bersaglio diverse

mediante proteine adattatrici chiamate F-box.

Una molecola di ubiquitina si lega alle catene di

lisina della proteina bersaglio. Il ciclo si ripete più

volte: si forma una proteina poliubiquitinata. Le

proteine bersaglio sono riconosciute da E3

attraverso il residuo N-terminale. L’identità del

primo residuo ha un’influenza sull’emivita della

proteina.

La proteina poliubiquitinata viene indirizzata al

proteasoma per la degradazione.

Il proteasoma 26S è altamente conservato negli

eucarioti.

Il nucleo centrale 20S è costituito da quattro

anelli (2 anelli alfa e 2 anelli beta) di 7 subunità

ciascuno che formano una struttura a barile.

Alcune subunità beta hanno attività proteolitica.

Ci sono due particelle regolatrici 19S, formate

da 18 subunità ciascuna, che deubiquitinano e

denaturano le proteine che entrano nel “barile”,

con attività ATPasi. Le molecole di ubiquitina

vengono dunque recuperate.

Struttura tridimensionale delle proteine

La stru(ura tridimensionale della proteina gli perme(e di svolgere la sua funzione.

Il primo ad occuparsi del processo del folding fu Anfinsen e studiò la denaturazione delle

proteine. Le proteine denaturate perdono la stru(ura

terziaria e secondaria, mantenendo però la

primaria (catena amminoacidica). La

conformazione denaturata è molto

disordinata, come quando la proteina è

appena stata sinte@zzata a livello del

ribosoma. Una volta rimosso l’agente

denaturante la proteina può rinaturarsi.

La denaturazione è indo(a da alcuni agen@:

• fisici (temperatura di mel@ng oltre la quale la proteina perde la sua stru(ura

funzionale, alta pressione, forze di torsione e s@ramento)

• chimici (valori estremi di pH, infaG le proteine sono nel loro ambiente ideale a pH

neutro quindi 7,4 solitamente, se il pH scende so(o i 3 o sale sopra i 10 la proteina

tende a denaturarsi o comunque a perdere la sua funzione, presenza di tensioaGvi,

quindi detergen@ o saponi che interferiscono con l’interazione idrofobica che

man@ene stru(urato il core idrofobo della proteina, solven@ e agen@ caotropici,

come urea e cloruro di guanidina, che interferiscono con la stru(urazione della

proteina denaturandola ad alte concentrazioni.

Anfinsen negli anni ‘60 lavorava con una ribonucleasi

piu(osto piccola (124 amminoacidi), che nella sua

conformazione na@va con@ene 4 legami disolfuro (S-S)

tra residui di cisteina. Aggiunse l’urea ad alta

concentrazione e un agente riducente, perché i pon@ S-

S si rompono lasciando gli zolfi liberi (legami covalen@

spezza@). O(enne la ribonucleasi in forma denaturata

con i pon@ disolfuro non più presen@. A(raverso un

processo di dialisi eliminò urea e mercaptetanolo e

notò che la proteina rioGeneva il 100% della sua

funzionalità.

Anfinsen a questo punto provò ad allontanare prima

solo il mercaptetanolo, lasciando l’urea, quindi i pon@

disolfuro si riformarono, ma la proteina rimaneva

denaturata. Dopo eliminò anche l’urea e la proteina si

rinaturava solo all’1%. Infine, aggiunse delle tracce di

agente riducente, così la proteina si rinaturò del tu(o.

In questo secondo esperimento, dopo

l’allontanamento del mercaptetanolo, i

pon@ disolfuro si riformavano in maniera

casuale, impedendo quindi la completa

rinaturazione della proteina. Aggiungendo

nuovamente delle tracce di

mercaptetanolo la proteina riformava i

correG pon@ disolfuro. Quindi concluse

che, in condizioni fisiologiche, le proteine

si ripiegano spontaneamente fino a

raggiungere la loro conformazione na@va.

Visto che ogni proteina ha la sua stru(ura

primaria, che porta sempre alla sua

conformazione funzionale, la stru(ura

pr