Appunti Advanced food analysis

HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC)

High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) was developed during the 1960s and, originally, HPLC was the acronym for High-Pressure Liquid Chromatography because it uses high pressures to push the mobile phase into the column.

Come dice il nome, si tratta di un sistema cromatografico liquido. Il cuore del sistema è una pompa che spinge il liquido all'interno delle colonne riempite di fase stazionaria. Qui si ha l'interazione dell'analita con fase mobile e fase stazionaria, infatti la fase mobile deve sciogliere gli analiti, quindi trascinarli in colonna, perciò deve avere affinità verso gli analiti (in gas cromatografia, non si ha interazione tra analiti e gas carrier che è inerte e serve solamente per trascinare gli analiti). Per questo motivo, in funzione della composizione della fase mobile e della fase stazionaria, si avranno interazioni diverse. Affinché gli analiti vengano separati,

Nell'analisi cromatografica liquida, il principale nemico è rappresentato dalle bolle d'aria presenti all'interno del sistema. Se il sistema si basa su una pompa che spinge un liquido all'interno di una fase stazionaria, se vi sono bolle d'aria, la pressione non sarà mai costante. È importante avere un flusso costante. Affinché la velocità lineare venga mantenuta costante, è necessario cambiare la pressione utilizzata.

Il tempo di analisi in HPLC convenzionale è pari a 30-45 minuti. Attualmente, per sviluppare analisi sempre più veloci, come è stato visto nella gascromatografia (colonne fast: più corte, più strette e con meno fase stazionaria), anche nella cromatografia liquida, si è passati da colonne lunghe 30 cm ad altre lunghe 5 cm. Se si riduce la lunghezza, è necessario ridurre anche il diametro interno e la fase stazionaria. In questo caso, non avendo

più un gas ma un liquido, la contropressione che si genera sarà molto più elevata. Il liquido fa più fatica a passare, quindi la pompa deve esercitare pressioni viavia maggiori. Ecco perché si hanno sistemi che arrivano a 1200 Bar.

N.B.Così come abbiamo visto in gascromatografia che, riducendo le dimensioni, è necessario via via aumentare la pressione delgas; anche nella cromatografia liquida, quando si riducono le dimensioni della fase stazionaria, per aumentare il numero dipiatti teorici, perciò effettuare le stesse analisi in tempi più brevi, si deve aumentare la pressione.

There are many advantages of HPLC over traditional low-pressure column liquid chromatography:

• speed many analyses can be accomplished in 30 minutes or less (we can analyse thermolabile compounds)
• a wide variety of stationary phases cambiando la tipologia di fase stazionaria, è possibile migliorare la risoluzione

è molto piùgraduale, perciò sta allargando. Se il gradiente è troppo basso, vi è il rischio di avere i picchi troppo larghi.→Then we have the pump. It is the core because it has to guarantee a constant flow into the system questo vale sia per lacromatografia liquida sia per la gascromatografia sia per la cromatografia impaccata (il flusso deve essere sempre costante,altrimenti si verifica un allargamento delle bande).Il sistema è più complesso rispetto ad un GC perché la pompa è a monte dell’iniettore.Lo scopo della pompa è flussare la fase mobile all’interno del sistema di iniezione con un flusso costante. Ecco perché ilnemico è rappresentato dalle bolle d’aria. Quando si prepara la fase mobile, vi saranno per forza bolle d’aria all’interno (dopospiega quali sono i “trucchi” per evitare la loro formazione).A differenza di un GC (dove si iniettava la

quantità decisa), qui vi è un loop, ovvero un'attività nota di volume che rimane sempre costante (la quantità di volume presente nel loop è una misura fisica). Se si ha una quantità di volume (di campione) sempre fissa che viene iniettata, allora si sta già superando uno dei problemi che si aveva nel GC, cioè la ripetitività delle iniezioni. Se prima si iniettava con una siringa, non si è così ripetibili, ecco perché lo standard interno aiuta. Ciò significa che, lavorando in HPLC, i casi in cui è possibile utilizzare uno standard esterno sono molto più numerosi rispetto alla gascromatografia (in quanto è stato risolto uno dei problemi critici della gascromatografia).

N.B. Importanza del loop di iniezione, in quanto consente di avere sempre iniezioni altamente ripetibili perché si inietta sempre la stessa quantità grazie al loop si ha un volume sempre uguale.

colonna e a raggiungere il detector, perciò quanto più sono corti, tanto più breve sarà il tragitto, perciò impiegherà meno tempo.➔ → → → →Reservoir Pump Injector Column Detector

Non si tratta di una tecnica distruttiva, infatti si potrebbero raccogliere gli analiti. Questa cosa si fa in HPLC preparativo, cioè quando si ha una matrice molto complessa in cui si vogliono separare le frazioni, si utilizzano colonne molto grandi e poi si raccolgono gli analiti in provette. Permette, quindi, di purificare le frazioni in modo controllato (es. in una provetta viene raccolto ciò che eluisce fino a 5 minuti, poi si cambia provetta dove si raccoglie ciò che eluisce da 5 a 10 minuti).

Quanto più vicine sono le frazioni, tanto più grandi devono essere le colonne per avere più fase stazionaria e quindi distanziarle. In questa fase non interessa avere picchi stretti, ma frazioni ben separate.

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