Modulazione delle vie di proliferazione cellulare mediata da vinclozolin in un modello in vitro di neuroblastoma umano

Alma Mater Studiorum - Università di Bologna

Dipartimento di Farmacia e Biotecnologie

Corso di Studio in Farmacia

Modulazione delle vie di proliferazione cellulare mediata da vinclozolin in un modello in vitro di neuroblastoma umano

Tesi di laurea in Tossicologia

Tesi Sperimentale

Presentata da: Maria Carmen

Relatore: Prof.ssa ***

Matricola n° 000000000

Correlatrici: Prof.ssa **** Dott.ssa *****

Anno accademico 2023/2024

Indice

• Indice
• 1. Introduzione......................................................................................................3
• 1.1 Gli interferenti endocrini........................................................................3
• 1.1.1 Classificazione degli IE................................................................4
• 1.1.2 Distribuzione ambientale ed esposizione umana........................14
• 1.2 Meccanismi d’azione degli IE..............................................................16
• 1.3 Tossicità degli IE a livello del SNC.....................................................19
• 1.4 Effetti epigenetici degli IE....................................................................22
• 1.5 Il VNZ..................................................................................................24
• 1.5.1 Neurotossicità del VNZ..............................................................27
• 2. Scopo della ricerca...........................................................................................28
• 3. Materiali e Metodi...........................................................................................30
• 3.1 Linea cellulare......................................................................................30
• 3.2 Terreni di coltura e soluzioni...............................................................30
• 3.2.1 Terreno di coltura.......................................................................30
• 3.2.2 Soluzioni.....................................................................................31
• 3.3 Allestimento delle colture cellulari.......................................................32
• 3.4 Differenziamento linea SH-SY5Y........................................................32
• 3.5 VNZ.....................................................................................................32
• 3.6 Test dell’Alamar Blue per la determinazione della vitalità neuronale....................................................................................................33
• 3.7 Test della sonda H DCF-DA per la determinazione della formazione di 2 ROS............................................................................................................35
• Indice
• 3.8 Western Blotting per la determinazione della fosforilazione di Akt e mTOR e dell’attivazione di p53, Bax e Bcl2...............................................36
• 4. Risultati............................................................................................................38
• 4.1 Valutazione della citotossicità del VNZ in cellule SH-SY5Y..............38
• 4.2 Valutazione della formazione di ROS in cellule SH-SY5Y................39
• 4.3 Analisi dei livelli di pAkt, p-mTOR, p53, Bax e Bcl2 dopo trattamento con VNZ a concentrazioni subtossiche......................................................40
• 5. Discussione.......................................................................................................42
• 6. Bibliografia......................................................................................................45
• 7. Ringraziamenti................................................................................................53

Introduzione

Gli interferenti endocrini

A partire dagli anni Cinquanta, si è evidenziato un aumento di patologie, quali il cancro al seno e alla prostata, e di disturbi della riproduzione, come l’infertilità. Questi effetti sono stati correlati con l’esposizione a determinate sostanze chimiche, appartenenti alla classe degli interferenti endocrini (IE). Nel 1996, la Environmental Protection Agency (EPA) definì per la prima volta nella storia queste molecole come “sostanze esogene o miscele di sostanze che interferiscono con la sintesi, secrezione, trasporto, metabolismo, legame con il recettore o eliminazione degli ormoni” [1]. Gli studi sugli IE hanno indotto l’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) a modificare questa definizione, nel 2002, affermando che “un IE è una sostanza esogena o una miscela di sostanze che altera le funzioni del sistema endocrino e conseguentemente causa effetti avversi in un organismo sano, oppure sulla sua progenie” [2].

L’ultima definizione di IE la diede, nel 2012, la Endocrine Society, dichiarando che tali molecole sono “sostanze esogene che interferiscono con ogni aspetto dell’azione ormonale”. Tra la precedente definizione e quest’ultima vi sono due differenze: la prima è la sostituzione di “funzione del sistema endocrino” con “azione ormonale”, intesa più in generale come attivazione dei recettori ormonali e conseguente risposta cellulare; la seconda consiste nell’eliminazione di “effetti avversi” perché questa terminologia è poco precisa, potrebbe fuorviare e influenzare studi scientifici su queste sostanze [2].

L’immissione degli IE nell’ambiente risale agli anni Quaranta del Novecento e ad oggi si conoscono circa mille molecole che appartengono al gruppo degli IE, che risulta ancora in gran parte sconosciuto. Queste sostanze sono oggi molto diffuse nell’ambiente. Gli IE hanno origine sia naturale, come micotossine e isoflavoni, sia sintetica, come fungicidi, pesticidi, metalli pesanti, prodotti chimici industriali, plastificanti e farmaci. Ogni giorno l’uomo è esposto agli IE, a basse dosi e costantemente, attraverso tre fonti: l’ingestione di cibo e acqua contaminati e l’inalazione di aria inquinata [3]. Gli IE si distribuiscono in fiumi e mari a causa del rilascio di acque reflue urbane e industriali; vengono immessi nell’atmosfera attraverso i gas di scarico delle automobili, delle industrie e per via dell’incenerimento di rifiuti. Queste sostanze, dalle acque e dall’atmosfera, si depositano nel suolo, nel terreno e nei fondali marini [4]. Di conseguenza, pesci, uccelli e mammiferi entrano in contatto con esse tramite il loro nutrimento e queste si accumulano nei tessuti animali. Gli IE entrano nel processo di biomagnificazione che comporta l’aumento della loro concentrazione salendo nella catena trofica e, in tale modo, raggiungono l’uomo attraverso la dieta [5].

Alcuni IE sono caratterizzati da un’alta stabilità molecolare, che li rende sostanze molto persistenti. Tali sostanze sono ad alto rischio per la salute umana e la loro produzione è stata bandita circa vent’anni fa. Nonostante questo, essi possono essere ancora rilevabili nell’ambiente. Altri IE, invece, sono degradati più facilmente da batteri o altri processi chimici come la fotolisi e l’ossidoriduzione [4].

La preoccupazione per l’impatto di queste sostanze sulla salute umana è cresciuta particolarmente negli ultimi trent’anni. Essi, infatti, interagendo con il sistema endocrino attraverso molteplici meccanismi d’azione, comportano disturbi nella riproduzione, che possono anche essere transgenerazionali e sono fattori di rischio per l’insorgenza di patologie come il cancro [6]. Negli ultimi anni si sta osservando il ruolo di queste molecole a livello centrale. Gli IE possono provocare disturbi comportamentali e neurotossicità non solo a causa dell’alterazione di sintesi, metabolismo e rilascio di molecole endogene, come neuropeptidi, neurotrasmettitori e neurormoni, ma anche attraverso l’attivazione di pathways molecolari dannosi per le cellule nervose [4].

Classificazione degli IE

Gli IE possono essere classificati in vari modi: nel 2012 l’OMS, diede una sua classificazione, suddividendoli in quattro macro-classi. Questa suddivisione si basa sulle caratteristiche chimico-fisiche, di accumulo nei tessuti e di applicazione [7].

• Sostanze alogenate persistenti e bioaccumulabili o Persistant organic Pollutants (POPs):

I POPs sono sostanze chimiche persistenti nell’ambiente con effetti negativi diretti sulla salute umana. Esse sono altamente tossiche, nonostante siano presenti in quantità inferiori rispetto ad altre sostanze [8]. Queste sostanze sono rilasciate nell’aria, nel suolo e nelle acque e, poiché non si degradano, possono essere trasportate a lungo raggio. Accumulandosi nei tessuti animali, entrano nella catena alimentare e, in questo modo, raggiungono l’uomo [9]. In accordo con la Convenzione di Stoccolma tenutasi nel 2001, la produzione di alcune di queste sostanze è stata limitata, mentre per altre è stata definitivamente messa al bando. I primi POPs identificati vennero chiamati “dirty dozen” poiché causavano gravi danni sull’uomo e sull’ecosistema: la loro produzione è stata vietata. Questi sono: aldrina, clordano, diclorodifeniltricloroetano, dieldrina, endrina, eptacloro, esaclorobenzene, mirex, toxafene, policlorobifenili, dibenzodiossine e policlorodibenzofurani [3]. Le più alte concentrazioni di POPs si trovano nelle aree urbane e industriali e sono dovute alle emissioni di gas e al trattamento delle acque reflue, mentre nelle zone rurali, la presenza di questi inquinanti è dovuta principalmente alle sostanze usate nell’agricoltura [9]. La categoria dei POPs non comprende soltanto i composti capostipite, ma anche i congeneri, ovvero i loro omologhi o isomeri. I congeneri sono un ampio numero di molecole: per tale motivo, l’esposizione umana a queste sostanze e la loro presenza nell’ambiente è estremamente elevata.

Tra i POPs troviamo le seguenti molecole.

Le diossine (Fig. 1) sono un ampio gruppo di molecole che comprendono le policlorodibenzodiossine, i dibenzofurani, i bifenili e altri composti diossino-simili [10]. Queste molecole esistevano prima dell’industrializzazione soltanto in piccolissime quantità, dovute a processi, come la combustione, o eventi geologici, come l’eruzione vulcanica. La loro produzione massiva, cominciata intorno agli anni Quaranta, è stata causata dalle attività industriali dell’uomo [10]. Le diossine sono estremamente persistenti nell’ambiente e molto liposolubili. L’uomo ne viene esposto principalmente attraverso l’ingestione di alimenti di origine animale tra cui carne, pesce e latticini [11].

Fig.1 Struttura base delle diossine, variamente sostituita per ogni molecola del gruppo.

La diossina più tossica per contaminazioni di tipo ambientale e alimentare è la 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-diossina (TCDD) (Fig. 2). Essa è estremamente bioaccumulabile nei tessuti umani: il suo tempo di dimezzamento si è stimato essere di 7-11 anni. La TCDD è nota per essere stata ampiamente utilizzata dalle forze militari degli Stati Uniti nella Guerra del Vietnam come defoliante. La molecola veniva chiamata Agente Arancio e il suo impiego era finalizzato ad eliminare la copertura forestale e distruggere le colture. Sono stati svolti studi sull’esposizione dei soldati americani a questa molecola e si è riscontrato che a distanza di quattro decenni questa diossina fosse ancora presente nei tessuti lipidici [10].

Fig.2 Struttura della TCDD.

Il meccanismo d’azione delle diossine si esplica attraverso il loro legame con il recettore degli idrocarburi arilici aromatici: esso può indurre la trascrizione o la repressione di geni, in particolare quelli del citocromo P450. Inoltre, le diossine possono interagire con i recettori nucleari per gli estrogeni e per gli androgeni [12]. A causa di queste interazioni, le diossine sono implicate in una lunga serie di disturbi: esse sono fattori di rischio per il cancro; comportano deficienza immunitaria, anomalie riproduttive e dello sviluppo, insorgenza di patologie come il diabete e la cloracne. Possono inoltre compromettere il funzionamento del sistema nervoso centrale (SNC) e periferico [10].

I policlorobifenili (PCB) sono una classe costituita da 209 composti organoclorurati e singolarmente indicati come congeneri (Fig. 3). A partire dagli Quaranta, le miscele di PCB furono prodotte in grandi quantità in tutto il mondo per diverse applicazioni industriali. È stato stimato che la produzione mondiale di queste molecole fosse di 1.2 - 2 milioni di tonnellate. Ad oggi si ritiene che 0,2 - 0,4 milioni di tonnellate siano ancora presenti nell’ambiente data la loro persistenza [13]. Sono stati studiati a fondo gli effetti che i PCB hanno sull’uomo: possono causare endometriosi e fibromi, tumori uterini e soppressione dell’attività degli ormoni tiroidei e del sistema immunitario. I PCB aumentano il rischio di diabete [14] e hanno un impatto negativo sullo sviluppo neurologico [15].

Figura 3. Struttura base dei PCB. I congeneri sono variamente sostituiti.

Il diclorodifeniltricloroetano (DDT) (Fig. 4) è un insetticida molto lipofilo, semivolatile, introdotto durante la Seconda Guerra Mondiale con applicazioni principalmente agricole e usato anche contro la malaria. È stato stimato che la sua produzione mondiale fosse di 4,5 milioni di tonnellate. Il suo tempo di emivita è di 10 - 15 anni. Il DDT viene trasportato a lungo raggio da aria e acqua ed è estremamente bioaccumulabile oltre che persistente nell’ambiente [16]. Nel 1980, la dispersione di questa sostanza insieme ad altre simili come dicofol e diclorodifenildicloroetilene (DDE) causò la contaminazione del Lago Apopka, in Florida [17]. Le conseguenze riscontrate da questo evento furono il declino della popolazione di alligatori del Lago Apopka e una diminuzione della vitalità delle loro uova. Vennero inoltre riportate per circa un decennio diverse anomalie nello sviluppo delle gonadi dei piccoli alligatori. Inoltre, furono rilevati squilibri nei valori di concentrazione degli ormoni sessuali nel sangue. Questi valori, confrontati con quelli degli alligatori dei laghi vicini, vennero correlati all’azione del DDT [18]. Questa sostanza venne bandita dapprima in Svezia, poi negli Stati Uniti e a seguire in tutti gli altri Paesi. Gli effetti del DDT sulla salute umana sono molteplici: essa può dare insorgenza di leucemie e linfomi. Inoltre, può causare altri tipi di cancro come al pancreas, al cervello, al seno e alla prostata. Il DDT è in grado di aumentare il rischio dello sviluppo di endometriosi e di dare alterazioni del ciclo mestruale. Infine, si sono osservati i suoi effetti dannosi nello sviluppo neurologico [16].

Figura 4. Struttura del DDT.

(PFOS) Il perfluoroottansulfonato (Fig. 5) è un surfactante sintetico, con molti atomi di fluoro. La sua struttura molecolare termina con un gruppo solfonato [7]. Il PFOS è idrofobico ma proteinofilico: è una sostanza che si accumula in particolare nel fegato, proprio per il suo legame con le proteine circolanti che raggiungono quest’organo. Si accumula meno nel tessuto adiposo, a differenza degli altri POPs [7]. La produzione di questa molecola è terminata nel 2001. Essa veniva utilizzata per la produzione di polimeri che venivano incorporati nei repellenti per le macchie e in altri agenti di rivestimento superficiale [19].

Figura 5. Struttura dei PFOS.

L’acido perfluoroottanico (PFOA) (Fig. 6) è anch’esso un surfactante. Ha una struttura simile al PFOS, ma termina con un gruppo carbossilico. Il PFOA ha un grande potenziale di accumularsi nei tessuti umani lipofili. La sua maggiore applicazione fu quella di emulsionante nella produzione di fluoropolimeri come il Teflon. Inoltre, viene utilizzato nelle industrie per la sua capacità di conferire a prodotti come abbigliamento, tappeti e pentole la resistenza ad alte temperature [19].

Figura 6. Struttura dei PFOA.

Gli effetti di PFOS e PFOA sono stati riscontrati in diversi studi epidemiologici nella riproduzione maschile e femminile. Causano cambiamenti nei livelli di ormoni quali estrogeni, testosterone, ormone luteinizzante e follicolostimolante [20]. Inoltre, sono stati osservati effetti neurotossici di tali sostanze, che conducono ad un ritardo dello sviluppo neuromotorio, diminuzione delle funzioni cognitive e di memoria [21].

• Sostanze meno persistenti e meno bioaccumulabili
• Plasticizzanti: ftalati
• Fenoli non alogenati: bisfenolo A (BPA)

Gli ftalati (Fig. 7) sono esteri dell’acido ftalico e comprendono un vasto gruppo di sostanze di cui il di(2-etilesil)ftalato (DEHP) (Fig. 8) è capostipite. Queste sostanze si usano principalmente nell’industria delle plastiche come plastificanti, ovvero come sostanze aggiunte alla materia per migliorarne la modellabilità e flessibilità. Il DEHP si impiega anche come solvente nei prodotti per la cura personale, veicolo per pesticidi, negli imballaggi alimentari e nella produzione di vari oggetti quali dispositivi medici, giochi, cavi, inchiostri per stampanti, colori, vernici e adesivi [22]. Gli effetti negativi degli ftalati sembrano interessare l’apparato genitale-riproduttivo maschile, causando una diminuzione dei livelli di testosterone, ipospadia e criptorchidismo [23]. Tali sostanze sono neurotossiche e, recentemente, è stato riportato un effetto di danneggiamento a livello degli astrociti [24].

Figura 7. Struttura di base degli ftalati.

Figura 8. Struttura di DEHP.

Il BPA (Fig. 9) è un monomero plastificante che è stato molto usato nei paesi industrializzati per la produzione di plastiche di uso alimentare, come contenitori riutilizzabili di cibo e bevande, biberon per bambini, stoviglie e bottigliette d’acqua, ma anche per la produzione di lenti per gli occhiali, tubi, oggetti di elettroni