Schemi della parte strumentale - Analisi dei medicinali 2

Anna Gallina 2° anno CTF 2024-2025

Schema Analisi dei Medicinali 2, Parte Strumentale

Spettrofotometria UV-visibile

Principio: gli atomi e le molecole, in base alla propria tipologia, riescono ad assorbire una sola e specifica lunghezza d’onda, che ha un’energia uguale a quella che serve a un elettrone degli orbitali più esterni a fare un salto energetico, passando a un’orbitale con maggiore energia (legame → antilegame). In base al tipo di radiazione assorbita è possibile identificare qualitativamente uno specifico atomo/molecola. Le energie assorbite corrispondono a frequenze e lunghezze d’onda che si trovano nelle regioni spettrali della luce visibile e dell’ultravioletto vicino e lontano.

• Transizioni in un atomo: transizioni nette e separate fra loro, solamente da un orbitale all’altro con segnali di assorbimento ben definiti, che corrispondono a lunghezze d’onda ben precise.
• Transizioni in una molecola: spettri di assorbimento più complessi perché le molecole assorbono anche una moltitudine di lunghezze d’onda che permettono di fare i salti elettronici anche nei sottolivelli rotazionali e vibrazionali (in soluzione le molecole vibrano e si urtano fra di loro).

Stati di transizione

Dallo stato fondamentale S0, dopo l’eccitazione dovuta all’assorbimento, l’elettrone può andare:

• Stati di singoletto S1 o S2, dove si mantiene lo spin dell’elettrone che ha fatto la transizione.
• Da uno stato di singoletto eccitato a uno stato di tripletto T1 o T2 che richiede un cambio di spin (intersystem crossing).

Orbitali molecolari

• σ e π, orbitali molecolari allo stato fondamentale.
• n, orbitali non leganti occupati dai doppietti elettronici su eteroatomi come ossigeno e azoto.
• σ* e π*, orbitali di antilegame a energia maggiore.

Transizioni elettroniche osservabili nell’UV-Vis

• n→π* in composti carbonilici.
• n→σ* in composti con ossigeno, azoto, solfuro e alogeni.
• π→π* in alcheni, composti carbonilici, alchini e composti con azoto.
• σ→π* e σ→σ* avvengono a livelli energetici troppo distanti e non sono visibili con la strumentazione.

La presenza di sostituenti all’interno della molecola aumenta la possibilità di movimento degli elettroni, come anche l’aumento della coniugazione diminuisce l’energia richiesta per l’eccitazione elettronica andando sempre di più verso l’assorbimento con la luce visibile.

Alcune transizioni, come quelle di molecole sature con elettroni spaiati, sono difficilmente osservate perché vengono coperte dai solventi che vengono impiegati per sciogliere i composti stessi. Questo perché il solvente instaura con le molecole dei legami che influenzano le energie degli stati fondamentali/eccitati e, di conseguenza, cambiano le energie necessarie per le transizioni elettroniche. Si cerca di avere solventi che interagiscono il meno possibile con le sostanze in esame. Accade questo per alcoli, tioli, ammine e solfuri. Per questo è necessario sempre considerare il cut-off dei solventi, ossia la lunghezza d’onda al di sopra della quale il solvente è trasparente, ossia non assorbe, e al di sotto della quale il solvente assorbe. Rappresenta, quindi, il limite al di sotto del quale non si può mai usare un solvente se le sostanze analizzate assorbono all’incirca a quelle stesse lunghezze d’onda.

L’acqua, l’etanolo e il metanolo vengono definiti come dei solventi perfetti perché assorbono sotto ai 200 nm.

Gruppi cromofori

Gruppi cromofori: gruppi funzionali in grado di conferire colore e che hanno un assorbimento caratteristico, ossia corrispondono a specifiche lunghezze d’onda. Si utilizza come parametro ε, che rappresenta la probabilità con cui avviene una determinata transizione: maggiore è ε, maggiore sarà la quantità di quanti assorbiti per quella lunghezza d’onda; di conseguenza, sarà più sensibile quella tecnica e basterà meno sostanza per vedere l’assorbimento.

• Cromofori coniugati: l’energia di transizione diminuisce, ossia la lunghezza d’onda aumenta rispetto a quella dei cromofori separati; avviene lo spostamento batocromico. Questo perché la coniugazione permette agli orbitali degli stati eccitati di essere più vicini fra loro.
• Composti aromatici: lo spostamento batocromico è ancora più evidenziato.

Se due cromofori sono presenti contemporaneamente nella soluzione, l’assorbimento che si ottiene è dato dalla somma degli assorbimenti dei singoli composti; avviene un fenomeno sommatorio.

Colore: la colorazione delle sostanze naturali (doppi legami coniugati) è dovuta a transizioni elettroniche nel campo del visibile, ossia che avvengono dopo i 400 nm di lunghezza d’onda e prima degli 800 nm. In particolare, agli occhi non appare il colore realmente assorbito ma il colore complementare.

Spettro di assorbimento

Spettro di assorbimento: grafico che indica come e quali radiazioni vengono assorbite da una sostanza quando le vengono inviate delle radiazioni luminose, ossia il complesso di radiazioni monocromatiche che un composto è in grado di assorbire. Ogni sostanza ha un proprio spettro in base ai gruppi cromofori presenti; in base allo spettro si possono distinguere qualitativamente le varie sostanze, tramite confronto con uno standard. Si possono avere spettri a righe o a bande che mostrano gli stati quantizzati e i trasferimenti quantizzati di energia fra di essi.

• Ascissa: lunghezza d’onda.
• Ordinata: assorbanza (quantità di luce assorbita).

Radiazioni

• I0: radiazione incidente inviata dalla sorgente luminosa.
• I: radiazione che fuoriesce dal campione, ossia che non è stata assorbita dal campione e che va al rivelatore.
• Assorbimento: radiazione che viene assorbita dal campione e non esce. Anche le pareti del contenitore possono assorbire la radiazione, andando a sovrastimare l’analita.

L’intensità di I0 è data dalla somma dei fotoni che vengono assorbiti e quelli che vengono trasmessi al rivelatore. Ma possono esserci anche altre radiazioni a causa di alcuni fenomeni:

• Riflessione: la radiazione colpisce un mezzo che la rimanda in un’altra direzione. Fenomeno ridotto attraverso l’impiego di soluzioni diluite e con il confronto con un bianco, ossia quando la cuvetta è riempita solamente con il solvente senza l’analita. Analizzando prima il bianco, lo strumento annulla tutta quella serie di errori dovuti alla riflessione, insieme ad altri fenomeni che non sono legati alla concentrazione della sostanza analizzata. La riflessione può avvenire anche fra aria e parete e fra parete e soluzione.
• Diffusione: la radiazione entra nel campione e trova dei corpuscoli che la diffondono in varie direzioni. Per sostanze pure e prive di particelle è trascurabile. Può avvenire anche a causa di grosse molecole.
• Rifrazione: la radiazione entra in un mezzo con un determinato angolo che viene deviato e, quindi, modificato dal mezzo stesso.

Legge di Lambert-Beer

• Legge di Lambert: la quantità di luce assorbita da un determinato spessore di una sostanza omogenea è proporzionale all’intensità della luce incidente, ossia l’intensità della luce incidente decresce con una progressione geometrica all’aumentare dello spessore in progressione aritmetica.
• Legge di Beer: la quantità di luce assorbita non è solo proporzionale all’intensità della luce incidente e allo spessore, ma anche alla concentrazione. L’intensità di un fascio parallelo di una radiazione monocromatica decresce a mano a mano che aumenta la concentrazione della sostanza assorbente.
• Legge di Lambert-Beer: A = a*b*c dove A è l’assorbanza (-log I/I0), b è lo spessore della cuvetta (1 cm), c è la concentrazione del campione e a è una costante di proporzionalità.

Si usa a, assorbività, quando la concentrazione è espressa in g/L; mentre si usa ε, coefficiente di estinzione molare, quando la concentrazione è espressa in moli/L.

Se ε assume valori maggiori di 10.000, si tratta di assorbimenti ad alta intensità, se è minore di 1000 si hanno assorbimenti a bassa intensità; se è compreso fra 100-1000, si hanno transizioni proibite.

Rappresenta anche la probabilità che avvengano salti elettronici: se una sostanza assorbe tanto, allora la probabilità dei salti elettronici è elevata; mentre se una sostanza assorbe meno, ci sono dei passaggi o delle transizioni elettroniche che non sono favorite.

I/I0 è la trasmittanza; se T = 100% allora non c’è stato assorbimento e A assume valori infiniti, mentre se T = 0% allora tutta la radiazione è stata assorbita e A = 0.

Si preferisce usare l’assorbanza rispetto alla trasmittanza come misura, in quanto l’assorbanza graficamente ha un rapporto lineare mentre la trasmittanza una curva da cui è più difficile cogliere un valore di concentrazione.

La legge di Lambert-Beer permette di calcolare la concentrazione di un campione incognito andando ad analizzare la sua assorbanza e sapendo la sua ε dall’assorbimento di uno standard a concentrazione nota.

Scelta della lunghezza d’onda

Per calcolare la concentrazione di un campione è necessario porsi alla giusta lunghezza d’onda:

• Non si considera il primo assorbimento perché è vicino ai 200 nm ed è solitamente dovuto al solvente che si sovrappone.
• Solitamente ci si pone al massimo assorbimento, quando lo spettro di assorbimento assume un plateau, ossia una banda di assorbimento, che, anche se a lunghezze d’onda diverse, esprime lo stesso valore di assorbimento. Se il massimo assorbimento ha un valore di assorbanza maggiore di 1, non si può scegliere perché si esce dalla linearità. Se si ha un’unica assorbanza, ad esempio, a 1,3 allora bisogna diluire il campione.
• Anche se è il massimo assorbimento, non si sceglie se si ha un picco stretto poiché una minima radiazione potrebbe provocare una grande variazione di lettura. Inoltre, le lampade inviano il più possibile radiazioni monocromatiche al campione ma non sono precisissime e possono leggermente variare fra un’analisi e l’altra: se si ha un punto di plateau, si può ovviare a questo problema. Invece, se si sceglie un punto di flesso, anche spostandosi di poco da esso, si ottengono dei valori di assorbanza completamente diversi e non si ha più una relazione lineare.

Metodi quantitativi

A partire da una determinata lunghezza d’onda si ottiene la concentrazione del campione.

• Legge di Lambert-Beer: valida solamente in determinati range di concentrazione, ossia va da 10 a 10^-2-7 con un’assorbanza che deve essere fra 0,1 e 1. Per questo motivo, non si ha la sicurezza che ci sia sempre linearità. Con questo metodo, si deve conoscere necessariamente ε, anche andandosela a ricavare sperimentalmente con uno standard a titolo noto. Con questo metodo è importante anche diluire il campione.
• Confronto diretto: se non si sa ε, si determina la concentrazione incognita tramite un confronto diretto con uno standard a concentrazione nota, ossia si fa la proporzione As : cs = Ai : ci, sfruttando il fatto che ε è caratteristica di ogni sostanza. Attraverso questo metodo, però, non si è sicuri di essere dentro la proporzionalità e, quindi, conviene fare una retta di taratura, dove si hanno una serie di campioni da paragonare al campione incognito, ricavando un intervallo di concentrazioni in cui si ha una linearità di assorbanza.
• Retta di taratura: si preparano almeno 4 soluzioni che contengono la sostanza in esame a concentrazioni note e crescenti e si va a misurare la loro assorbanza. Dalle assorbanze si va a costruire una retta di taratura dove in ordinata si mette l’assorbanza e in ascissa la concentrazione. Si va a misurare l’assorbanza del campione incognito e si vede se il valore rientra all’interno della retta. Una volta accertato questo, si può andare a calcolare la concentrazione.

Se l’assorbanza è maggiore, si rifà l’analisi diluendo il campione, oppure se è minore, si cerca di aggiungere un altro punto alla retta di taratura, sperando che ci sia comunque linearità.

Fonti di errore

• Concentrazione: la linearità nella legge di Lambert-Beer viene rispettata solamente quando ci sono soluzioni diluite ma che comunque devono rispettare un determinato range (vedi sopra). Se le soluzioni sono troppo diluite, lo strumento non riesce bene a distinguere I da I0; mentre se si hanno soluzioni troppo concentrate, prevalgono alcuni effetti (aumenta l’indice di rifrazione) che alterano la misurazione.
• Effetto filtro: se le soluzioni sono troppo concentrate, il raggio cerca di passare ma viene bloccato dalle molecole di uno strato e non riesce ad avanzare, ottenendo un’assorbanza che non è lineare. Quindi, le molecole filtrano la radiazione che arriva alle molecole dello strato successivo insieme all’insorgenza di fenomeni come la rifrazione e la diffusione. Si possono formare anche degli aggregati che tendono ad assorbire molto meno e a dare rifrazione.
• Radiazioni monocromatiche: affinché la legge di Lambert-Beer sia valida, le radiazioni luminose mandate al campione devono essere monocromatiche, scegliendo un plateau a cui è associato un valore di assorbanza compreso fra 0,2 e 0,8. Se si inviano delle radiazioni non monocromatiche si rischia di assorbire delle radiazioni nei punti di flesso, dove la variazione di ε è molto elevata; infatti, tanto più stretto è il picco, tanto maggiore sarà l’errore se non si usa una radiazione monocromatica.

Banda naturale: rappresenta come il composto assorbe la radiazione ➢ Banda spettrale: rappresenta la sorgente ➢

Validità della legge di Lambert-Beer

Facendo la retta di taratura, si possono individuare delle deviazioni apparenti da essa, che possono essere positive o negative, dovute a diverse cause:

• Chimiche: si riconoscono cambiando la concentrazione del campione e possono essere:
  • Solvolisi ➢
  • Polimerizzazione ➢
  • Associazione o dissociazione ➢
  • Variazioni di pH che causano la presenza di due diverse specie in soluzione che assorbono in maniera diversa. Per questo è importante fissare il pH.
  • Torbidità della soluzione dovuta al solvente ➢
  • Temperatura: più è elevata, più le molecole si muovono; mentre se è bassa si hanno picchi di assorbimento più stretti.
• Strumentali: rilevabili variando il valore di b e mantenendo la concentrazione costante; possono essere:
  • Non monocromaticità di I0 ➢
  • Diffusione o riflessione ➢
  • Radiazione parassita ➢
  • Sorgente di luce instabile ➢

Punto isosbestico o isoassorbente

Punto isosbestico o isoassorbente: quando non si può tamponare il pH perché si hanno delle sostanze instabili, come acidi poliprotici che hanno stadi di dissociazione vicini fra loro, si va a leggere il valore di assorbanza al punto isosbestico, ossia il punto in cui le varie lunghezze d’onda di assorbimento delle varie specie dissociate si equivalgono fra loro. L’esistenza di un punto tale indica la presenza di due o più forme assorbenti in equilibrio fra loro; inoltre, gli spettri di assorbimento si equivalgono perché le ε delle specie in soluzione sono uguali.

Tecniche di bicromatismo

Tecniche di bicromatismo: si applicano per determinare contemporaneamente due sostanze che si trovano in miscela nella stessa cella, andando a leggere due cromofori a due lunghezze d’onda diverse. Avviene il fenomeno sommatorio, in cui le assorbanze dei due composti si sommano.

Si possono avere diversi casi:

• Spettri non sovrapponibili: le due sostanze presenti assorbono a due lunghezze d’onda diverse e si ottengono due picchi di assorbimento ben distinti. Quindi, ci si porta alla lunghezza d’onda del primo picco e si va a leggere l’assorbanza corrispondente da cui si calcola la concentrazione e poi si fa lo stesso anche con il secondo picco. Questo utilizzando anche il metodo delle rette di taratura.
• Spettri abbastanza sovrapponibili: una sostanza assorbe un po’ anche nello stesso punto in cui l’altra assorbe, quindi i due picchi di assorbimento si sovrappongono a una specifica lunghezza d’onda. Quindi, per calcolare la concentrazione delle due sostanze, si calcola prima la concentrazione della seconda sostanza al secondo picco che appare, facendo anche una retta di taratura, e poi, dall’assorbanza del primo picco si ottiene la concentrazione totale che corrisponde alla somma delle concentrazioni delle due sostanze. Per ottenere la concentrazione della prima, basta sottrarre dalla concentrazione totale, la concentrazione della seconda sostanza.
• Spettri molto sovrapponibili: non si può usare la tecnica del bicromatismo e, quindi, si vanno a separare le due sostanze nella fase preanalitica tramite estrazione, precipitazione, filtrazione,... e poi si vanno a calcolare le rispettive assorbanze.
• Sottrazione del bianco: si può evitare di fare un bianco solo se lo spettro di assorbimento è identico, ossia hanno la stessa ε e la stessa assorbanza, che è diversa dalla lunghezza d’onda del campione. Se, invece, il bianco (i reattivi in esso) assorbe più o meno alla stessa lunghezza d’onda del campione, allora si va a sottrarre troppa assorbanza o troppo poca, andando a sottostimare o a sovrastimare il campione.

Spettrofotometro

Spettrofotometro: si tratta di uno strumento che si basa sulle misurazioni della frequenza e dell’intensità delle radiazioni elettromagnetiche assorbite dalle sostanze in esame. In particolare, si inserisce la sostanza in analisi in una cuvetta, contenitore con pareti in quarzo (non assorbe le radiazioni luminose) che alle volte ha due pareti in quarzo (arriva la radiazione) e due in vetro (non arriva la radiazione perché il vetro assorbe fra i 200-340 nm). Lo spessore delle pareti della cuvetta utilizzata varia in base al cammino ottico che si vuole far compiere alla sostanza in modo