Microbiologia speciale e medica

Microbiologia medica

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Farmaci antibatterici

Definizione e principi generali

I farmaci antibatterici sono composti capaci di inibire la crescita batterica o di uccidere i batteri a concentrazioni che non risultano tossiche per l'organismo ospite. Questa proprietà fondamentale si chiama tossicità selettiva: il farmaco colpisce bersagli molecolari presenti nel batterio ma assenti, o sufficientemente diversi, nelle cellule eucariotiche dell'ospite.

I prodotti di origine naturale, derivati da funghi o altri batteri, si chiamano antibiotici; quelli ottenuti per sintesi chimica pura si chiamano chemioterapici. Nella pratica clinica, i due termini sono usati in modo intercambiabile. Importante invece la distinzione con i disinfettanti e gli antisettici, che hanno attività antimicrobica ad ampio spettro, funghi, virus, batteri, ma sono tossici per i tessuti vivi e quindi utilizzabili solo su superfici esterne o sulla cute integra.

L'azione di un farmaco può essere battericida, uccide irreversibilmente il batterio, o batteriostatica, inibisce la crescita reversibilmente: alla sospensione del farmaco, se il sistema immunitario non ha eradicato l'infezione, la crescita riprende. Questa distinzione non è assoluta: alcuni farmaci sono battericidi ad alte concentrazioni e batteriostatici a basse.

Meccanismi d'azione: come i farmaci colpiscono il batterio

Ogni farmaco antibatterico agisce interagendo con un bersaglio molecolare specifico nel batterio. I bersagli principali sono strutture o processi essenziali per la sopravvivenza batterica e sufficientemente diversi da quelli dell'ospite.

β-lattamici — Inibitori della sintesi del peptidoglicano

Il peptidoglicano è lo scheletro rigido della parete batterica: una struttura indispensabile per la maggior parte dei batteri e del tutto assente nelle cellule eucariotiche, il che lo rende un bersaglio ideale. I β-lattamici, penicilline, cefalosporine, carbapenemi, monobattami, contengono tutti un anello β-lattamico che imita strutturalmente il dipeptide terminale d-Ala-d-Ala dei precursori del peptidoglicano. Le transpeptidasi batteriche, dette anche PBP, Penicillin-Binding Proteins, scambiano questo anello per il substrato naturale e vi si legano covalentemente, venendo così inattivate in modo irreversibile. Il risultato è il blocco della formazione dei legami crociati tra le catene di peptidoglicano, con indebolimento della parete e morte batterica per lisi osmotica.

Le principali sottofamiglie: Penicilline, penicillina G, ampicillina, piperacillina — spettro variabile; Cefalosporine, per generazioni crescenti, dalla 1ª con spettro ristretto alla 5ª con attività anti-MRSA; Carbapenemi, imipenem, meropenem, ertapenem — spettro massimo, farmaci di riserva per MDR gram-negativi; Monobattami, aztreonam — solo gram-negativi.

Glicopeptidi — Altro blocco del peptidoglicano, diverso meccanismo

I glicopeptidi, vancomicina, teicoplanina, non si legano alle PBP ma direttamente al dipeptide d-Ala-d-Ala nel precursore del peptidoglicano, bloccando fisicamente sia la transglicosilazione che la transpeptidazione. Essendo molecole molto grandi e idrofile, non riescono ad attraversare la membrana esterna dei batteri gram-negativi: il loro spettro è quindi limitato ai gram-positivi.

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La vancomicina è il farmaco di riferimento per le infezioni gravi da stafilococchi meticillino-resistenti, MRSA, e per le infezioni da enterococchi resistenti. Negli ultimi anni sono stati introdotti nuovi glicopeptidi lipidici, dalbavancina, oritavancina, con emivita molto lunga che permettono somministrazioni settimanali.

Chinoloni — Inibitori delle DNA topoisomerasi

Le DNA topoisomerasi batteriche, DNA girasi e topoisomerasi IV, sono enzimi essenziali per la replicazione e la trascrizione del cromosoma batterico: gestiscono i superavvolgimenti del DNA tagliandolo e rilegandolo. I chinoloni si intercalano nel complesso ternario enzima-DNA quando l'enzima ha già tagliato il DNA, bloccandolo in questa configurazione instabile. Il risultato è la frammentazione del cromosoma e la morte rapida del batterio, effetto battericida.

Il capostipite è l'acido nalidixico, uso solo per UTI, spettro ristretto. I fluorochinoloni moderni, ciprofloxacina, levofloxacina, moxifloxacina, hanno spettro molto più ampio, gram-negativi incluso Pseudomonas, gram-positivi, micobatteri, e buona biodisponibilità orale. Moxifloxacina e levofloxacina hanno attività antipneumococcica rilevante e si usano in polmoniti comunitarie.

Altri meccanismi d'azione in sintesi

Macrolidi e aminoglicosidi inibiscono la sintesi proteica legandosi al ribosoma batterico, subunità 50S e 30S rispettivamente. I macrolidi, eritromicina, claritromicina, azitromicina, hanno effetto batteriostatico ma antiinfiammatorio. Gli aminoglicosidi, gentamicina, amikacina, causano errori di lettura del codice genetico e hanno effetto battericida.

Tetracicline e glicilcicline, doxiciclina, tigeciclina: bloccano la subunità 30S impedendo l'ingresso dell'aminoacil-tRNA. Ampio spettro incluso Chlamydia, Rickettsia, Mycoplasma.

Rifampicina, ansamicina: inibisce l'RNA polimerasi batterica con altissima specificità. Usata soprattutto per TBC, ma anche per Staphylococcus e Legionella in combinazione, mai in monoterapia: resistenza rapidissima.

Polimixine, colistina, polimixina B: si legano al lipide A del LPS dei gram-negativi, destabilizzano le membrane batteriche. Farmaci di riserva per MDR gram-negativi, a causa della tossicità renale.

Valutazione dell'attività in vitro: MIC e antibiogramma

La MIC, Concentrazione Minima Inibente, è la concentrazione più bassa di farmaco che impedisce la crescita visibile di un ceppo batterico in condizioni standardizzate. È il parametro quantitativo fondamentale per guidare la scelta terapeutica. Si determina con metodi di microdiluizione in brodo o con gradient strips, E-test. In base ai breakpoint stabiliti dall'EUCAST, i ceppi vengono classificati come Sensibili, S, Intermedi, I, o Resistenti, R.

Il metodo di Kirby-Bauer, disco-diffusione, è il metodo di routine nei laboratori clinici. Dischetti impregnati con quantità standardizzate di antibiotico vengono posti su una piastra di agar precedentemente inoculata con il ceppo da testare. Durante l'incubazione, 18-20 h a 35°C, il farmaco diffonde creando un gradiente di concentrazione. Dopo incubazione si misurano gli aloni di inibizione della crescita: alone grande = MIC bassa = ceppo probabilmente sensibile; alone piccolo o assente = ceppo resistente. I risultati vengono poi confrontati con i breakpoint EUCAST per la classificazione qualitativa S/I/R.

Resistenza agli antibiotici — Un problema globale

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La resistenza batterica agli antibiotici è uno dei problemi sanitari più urgenti del XXI secolo. Si distingue in resistenza intrinseca, caratteristica di specie, preesistente all'uso degli antibiotici — es. gram-negativi intrinsecamente resistenti ai glicopeptidi per la membrana esterna impermeabile, e resistenza acquisita, derivante da mutazioni spontanee o dall'acquisizione di geni di resistenza tramite plasmidi, trasposoni e integron.

Meccanismo 1 — Inattivazione enzimatica del farmaco

Le β-lattamasi sono enzimi che idrolizzano l'anello β-lattamico, rendendolo inattivo. Sono il meccanismo di resistenza ai β-lattamici più diffuso, soprattutto nei gram-negativi. Si dividono in β-lattamasi a serina, le più comuni, tra cui le ESBL — Extended Spectrum Beta-Lactamases — che idrolizzano cefalosporine di 3ª e 4ª generazione, e le KPC — Klebsiella pneumoniae carbapenemasi — che inattivano anche i carbapenemi, e metallo-β-lattamasi, NDM, VIM, IMP: idrolizzano quasi tutti i β-lattamici inclusi i carbapenemi, ma non i monobattami; insensibili agli inibitori delle β-lattamasi a serina.

Negli aminoglicosidi la resistenza enzimatica avviene tramite enzimi modificanti, acetiltransferasi, fosfotransferasi, nucleotidiltransferasi, che alterano chimicamente il farmaco impedendogli di legarsi al ribosoma.

Meccanismo 2 — Alterazione o sostituzione del bersaglio molecolare

MRSA, Staphylococcus aureus meticillino-resistente: il gene mecA, portato sull'isola cromosomica SCCmec, codifica per la PBP2a, una transpeptidasi alternativa con bassissima affinità per tutti i β-lattamici. L'efficacia di questa singola modifica è straordinaria: rende S. aureus resistente all'intera classe dei β-lattamici, ad eccezione delle cefalosporine di 5ª generazione come ceftarolina.

VRE, Enterococchi vancomicino-resistenti: il cluster genico vanA/vanB modifica il precursore del peptidoglicano sostituendo il terminale d-Ala-d-Ala con d-Ala-d-Lac, lattato. Questo cambia radicalmente l'affinità del sito per i glicopeptidi: la vancomicina non riesce più a legarsi al bersaglio.

Nei chinoloni la resistenza si sviluppa rapidamente per mutazioni spontanee nei geni gyrA/gyrB, DNA girasi, e parC/parE, topoisomerasi IV: le mutazioni puntiformi nel sito di legame del farmaco ne impediscono l'interazione con l'enzima. Per questo i chinoloni non vanno mai usati in monoterapia per infezioni gravi: la selezione di mutanti resistenti è rapida.

Meccanismo 3 — Riduzione dell'accumulo intracellulare del farmaco

Le pompe di efflusso sono trasportatori transmembrana che espellono attivamente il farmaco dalla cellula batterica prima che raggiunga concentrazioni efficaci. Pseudomonas aeruginosa esprime costitutivamente la pompa MexAB-OprM, che estrude β-lattamici, chinoloni e altri farmaci. Negli enterobatteri la pompa AcrAB-TolC contribuisce alla resistenza multi-farmaco. La perdita o la riduzione di espressione delle porine, canali proteici nella membrana esterna dei gram-negativi, riduce l'ingresso dei farmaci idrofili come i carbapenemi.

Concetto chiave — CRE, Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae, e ESKAPE, E. faecium, S. aureus, K. pneumoniae, A. baumannii, P. aeruginosa, Enterobacter, rappresentano le priorità assolute dell'OMS per lo sviluppo di nuovi antibiotici: ceppi con resistenza multipla per i quali le opzioni terapeutiche si stanno esaurendo.

Il microbiota umano

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Che cosa è il microbiota

Il microbiota umano è l'insieme di tutti i microrganismi, batteri, archea, funghi, virus, che colonizzano stabilmente il corpo umano senza causare malattia nelle condizioni fisiologiche. Il termine microbioma si riferisce invece all'insieme dei geni di questi microrganismi, che supera di circa 100-150 volte il numero di geni umani. Il Human Microbiome Project ha mappato sistematicamente queste comunità, rivelando una complessità e un'importanza fisiologica molto superiori a quanto immaginato.

Il microbiota ha co-evoluto con l'uomo per milioni di anni in un rapporto di mutualismo: l'ospite fornisce un ambiente nutriente stabile, e il microbiota svolge funzioni essenziali che l'ospite da solo non riuscirebbe a compiere in modo adeguato.

Microbiota intestinale — Il più complesso e studiato

Il colon ospita la comunità microbica più densa e diversificata del corpo umano: si stima che contenga fino a 10¹¹ batteri per grammo di contenuto fecale. I phyla dominanti sono Firmicutes, tra cui Lactobacillus, Clostridium cluster XIV e IV, Ruminococcus, e Bacteroidetes, Bacteroides, Prevotella. Seguono Actinobacteria e Proteobacteria in proporzione minore. La composizione è altamente individuale — simile agli individui di uno stesso nucleo familiare — e relativamente stabile nel tempo in assenza di perturbazioni.

Funzioni principali del microbiota intestinale

• Fermentazione delle fibre alimentari: i batteri metabolizzano i polisaccaridi non digeribili, fibre, producendo acidi grassi a catena corta, SCFA — butirrato, propionato, acetato — che costituiscono la principale fonte energetica per le cellule del colon, colonociti, riducono l'infiammazione e regolano la motilità intestinale.
• Resistenza alla colonizzazione: la normale flora batterica compete per i nutrienti e i siti di adesione con i patogeni, producendo batteriocine e modificando il pH locale. Per questo la distruzione del microbiota da antibiotici a largo spettro predispone alla colonizzazione da patogeni come Clostridioides difficile.
• Sviluppo e modulazione del sistema immunitario: il microbiota stimola il tessuto linfoide associato all'intestino, GALT, promuove la differenziazione dei linfociti T regolatori, Treg, e la produzione di IgA secretorie, e calibra il tono infiammatorio. Topi germ-free hanno un sistema immunitario profondamente ipotrofico.
• Sintesi di vitamine: alcuni batteri sintetizzano vitamina K₂, menaquinone, e alcune vitamine del gruppo B, B12, folati, biotina, riboflavina.
• Metabolismo degli acidi biliari: i batteri intestinali decongiugano e modificano gli acidi biliari primari, ciolici, in secondari, desossicolici, litocolici, influenzando l'assorbimento lipidico e la segnalazione ormonale epatica.

Microbiota degli altri distretti corporei

Cavo orale: circa 700 specie identificate, con estrema variabilità tra i diversi habitat, denti, gengive, palato, lingua, saliva. Batteri predominanti: Streptococcus, S. salivarius, S. mutans, S. sanguinis, Veillonella, Actinomyces, Fusobacterium. I microrganismi formano biofilm complessi e organizzati, la placca dentale, la cui alterazione è alla base di carie e parodontite.

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Cute: la composizione varia enormemente in base alle caratteristiche del sito, zone sebacee come il viso e il cuoio capelluto, zone umide come le pieghe inguinali e ascellari, zone secche come gli avambracci. Predominano Staphylococcus epidermidis e altri CoNS, Corynebacterium, Propionibacterium, oggi Cutibacterium, acnes nelle zone sebacee, e il lievito Malassezia. Questi commensali proteggono la cute dai patogeni e contribuiscono alla barriera cutanea.

Tratto genitale femminile: normalmente dominato da Lactobacillus, soprattutto L. crispatus, L. iners, L. jensenii, L. gasseri, che mantengono un pH vaginale acido, ≤4,5, producendo acido lattico e perossido di idrogeno. Questo ambiente acido inibisce i patogeni e protegge dalle IST. L'alterazione di questo equilibrio porta alla vaginosi batterica, Gardnerella vaginalis, Prevotella, Mobiluncus, associata a maggior rischio di parto pretermine e di acquisizione di HIV.

Disbiosi e sue conseguenze

La disbiosi è un'alterazione qualitativa o quantitativa della composizione del microbiota, che si traduce in una perdita di funzione o nell'emergenza di effetti patologici. Le cause più comuni sono: antibioticoterapia a largo spettro, soprattutto fluorochinoloni e clindamicina per il rischio C. difficile, dieta povera di fibre e ricca di zuccheri raffinati, stress psicologico cronico, infezioni acute, chirurgia addominale.

Le conseguenze della disbiosi intestinale sono state correlate a un numero crescente di patologie: infezione da Clostridioides difficile, più direttamente, malattie infiammatorie croniche intestinali, Crohn, rettocolite ulcerosa, sindrome metabolica e obesità, il microbiota influenza l'estrazione calorica dagli alimenti, allergie e asma, e forse disturbi dell'umore e condizioni neurologiche come il Parkinson, tramite l'asse intestino-cervello.

Concetto chiave — Trapianto di microbiota fecale, FMT: il trasferimento di feci da donatori sani a pazienti con CDI ricorrente ottiene tassi di eradicazione del 90%, superiori a qualsiasi regime antibiotico. È oggi raccomandato dalle linee guida per le CDI recidivanti dopo un secondo episodio.

Batteri sporigeni: Clostridi e Bacilli

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Le endospore: strutture di resistenza straordinaria

Le endospore sono strutture dormienti prodotte da alcuni batteri gram-positivi, principalmente Bacillus e Clostridium, in risposta a condizioni ambientali sfavorevoli, carenza di nutrienti, stress. Non sono forme riproduttive: ogni batterio forma una sola spora. La loro struttura è straordinariamente robusta: un cortex di peptidoglicano modificato, rivestimenti proteici multipli, coat, e la presenza di acido dipicolinico, DPA, chelato con ioni Ca²⁺ le rendono resistenti al calore secco e umido, autoclave a 121°C per 15' le uccide, ma le temperature normali di cottura no, ai raggi UV, ai disinfettanti chimici, incluso il cloro in concentrazioni normali, alla disidratazione. La germinazione avviene quando le condizioni ambientali tornano favorevoli.

Clostridium tetani e il tetano

Clostridium tetani è un bacillo gram-positivo, anaerobio obbligato, il cui nome diagnosticamente utile deriva dalla forma della spora terminale che gli dà l'aspetto di una bacchetta da tamburo. È ubiquitario nel suolo e nel tratto intestinale di molti animali. La malattia non è causata dall'invasione tissutale del batterio, ma dalla tetanospasmina, una delle neurotossine più potenti in natura.

Meccanismo d'azione della tetanospasmina

La tetanospasmina è una proteasi zinco-dipendente che, una volta assorbita dai terminali nervosi motori, migra in modo retrogrado lungo gli assoni fino alle sinapsi del midollo spinale. Qui cliva la sinaptobrevina, VAMP, una proteina SNARE essenziale per il rilascio dei neurotrasmettitori. Il bersaglio specifico sono le sinapsi inibitorie interneurali che rilasciano GABA e glicina: bloccando questi neurotrasmettitori inibitori, si ha una stimolazione motoria continua e incontrollata. Il risultato clinico è la contrattura muscolare tonica, trismo, opistotono, risus sardonicus, spasmi generalizzati con iperestimolazione sensoriale.

Clinicamente il tetano si manifesta con trismo, incapacità di aprire la bocca per spasmo dei masseteri, come primo segno, seguito da rigidità nucale, disfagia, risus sardonicus, smorfia facciale da contrattura dei muscoli facciali, opistotono, iperestensione arcuata della colonna per spasmo dei muscoli paraspinali. Gli spasmi possono essere scatenati da stimoli minimi, rumore, luce, tatto, e possono causare fratture vertebrali. La morte avviene per insufficienza respiratoria.

Diagnosi e terapia: la diagnosi è clinica