Microbiologia e microbiologia applicata

Microbiologia

La microbiologia è la scienza che studia gli organismi microscopici come i microbi o microorganismi. Studieremo i: batteri (le più piccole unità viventi), miceti (cellula eucariotica) (funghi), virus, protozoi (parassiti eucarioti).

Batteri

La storia

L’interazione con i microrganismi è stata inconsapevole ma sempre presente a partire dall’esistenza dell’uomo; ad esempio, il fatto che i liquami della città dovessero essere portati fuori dai centri abitati. La microbiologia si origina da conoscenze pregresse della medicina studiate già da Ippocrate che diceva che ci sono quattro elementi che tengono in equilibrio un corpo (sangue, flegma ovvero il muco, bile gialla e bile nera). Questa teoria non implicava la possibilità di un contagio, ma non fu così.

Con l’arrivo della cultura islamica con Avicenna nacque l’idea di un contagio. Ad un certo punto la cultura islamica non influenzò più l’occidente e decadde anche questa cultura araba. Nel 1300 venne accettata questa teoria pensando che il contagio avvenisse attraverso la respirazione dei cattivi odori (miasmi). Il medico della peste andava a visitare i pazienti indossando una maschera col becco dove dentro metteva degli aromi e spezie per non ammalarsi. Fracastoro descrive per la prima volta la malattia che si può trasmettere da una persona infetta ad una sana.

Un ottico olandese, Leeuwenhoek, iniziò ad analizzare i microorganismi utilizzando un rudimentale microscopio, disegna quindi ciò che lui vede ovvero i batteri che lui chiama animalucoli. Nella seconda metà dell’800, grazie a Pasteur (scopre il virus della rabbia e come curarla, la pastorizzazione, viene anche convocato da Napoleone III per risolvere il problema del vino che diventa aceto, teoria della generazione spontanea ovvero che dai materiali in putrefazione si originassero mosche, smentita sottoponendo la carne a calore) e Koch (postulati di Koch; prelevando del sangue da un topo malato e iniettandolo nel topo sano, quello sano si sarebbe dovuto ammalare quindi da entrambi i topi malati si sarebbe dovuto isolare lo stesso microorganismo e mette a punto le tecniche di isolazione dei microorganismi), due microbiologi.

Tassonomia degli organismi viventi

Batteria, archaea ed eucaria sono i tre domini più vasti, parlando dei batteri noi indicheremo solo genere e specie: il genere si scrive in maiuscolo e la specie in minuscolo.

Lo studio di qualsiasi microorganismo parte dall’utilizzo del microscopio, più specificamente con il microscopio ottico. Come funziona? Una lente si trova nell’obiettivo e l’altra nell’oculare; queste due lenti vengono illuminate da una lampada sottoposta alle lenti. Grazie al microscopio possiamo osservare dimensioni che vanno dal millimetro al micrometro e si evidenzia anche la colorazione di Gram. Per uno studio più approfondito si utilizza il microscopio elettronico a scansione (sfrutta gli elettroni che vengono respinti dalla zona del campione vicina alla superficie per generare l’immagine) o trasmissione (rivela elettroni che passano attraverso un campione). Questo microscopio ingrandisce fino ai nanometri. La maggior parte dei microorganismi è procariote.

Microscopio ottico e microscopio elettronico

Ci sono gli elettroni per dare energia, c’è un fascio di elettroni e in questo modo avremo una risoluzione maggiore e vedremo fino a 0.2 nanometri, infatti, è l’unico microscopio che ci permette di osservare i virus.

Cianobatteri

I cianobatteri/cianoficee sono stati i primi batteri presenti sulla superficie terrestre e sono anche tra i pochi che fanno sintesi clorofilliana.

Morfologia dei batteri

• Cocchi: Stafilococchi raggruppati in ordine casuale dal greco stafilè ovvero grappolo d’uva, streptococchi quando sono messi in fila, diplococchi chicco di caffè quando sono presenti a coppie, diplococchi a punta di lancia.
• Bacilli: Streptobacilli, bacilli a palizzata/pacchetto di sigari ovvero che si mettono in ordine uno accanto all’altro, a lettere cinesi.
• Vibrioni: Presentano una virgola.
• Spirilli: Due curve e spirochete (batteri avvolti).

Struttura della cellula batterica

I batteri posseggono un DNA bicatenario circolare. Il cromosoma batterico è chiuso ad anello ed è molto lungo, all’interno della cellula, il cromosoma deve essere super avvolto. Per poter essere racchiuso il cromosoma viene aiutato dall’enzima girasi, ovvero un enzima che fa parte della famiglia delle topoisomerasi di tipo II. Come avviene il riavvolgimento dei cromosomi? Vengono in primis girati a strutture ad ansa e successivamente in strutture ad ansa super avvolte questa volta grazie all’enzima topoisomerasi di tipo I. Il citoplasma è racchiuso dalla membrana citoplasmatica e immersi in questo liquido troviamo i ribosomi a 70 S (50 + 30) (coefficiente di sedimentazione). La membrana citoplasmatica è formata da un doppio strato fosfolipidico, teste idrofobe e code idrofobiche.

Funzioni della membrana citoplasmatica

• Contiene il citoplasma
• Barriera osmotica (diffusione passiva)
• Sito di attività metaboliche grazie alla presenza di enzimi biosintetici. Inserite nella membrana troviamo anche delle proteine respiratorie (corrispettivi dei mitocondri nella cellula eucariotica).
• Regola gli scambi con l’esterno grazie ad enzimi chiamati permeasi* che fanno in modo che entrino le sostanze necessarie ed escano le sostanze di scarto. *Le permeasi sono delle proteine altamente specifiche per ciascun substrato e sono note anche con il nome di traslocasi o trasportatori (carrier).

Effetti della pressione osmotica

In condizione isotonica, gli scambi sono in equilibrio. In ambiente ipotonico il batterio va incontro a lisi e in condizione ipertonica invece il batterio va incontro a raggrinzimento.

Parete cellulare

La parete cellulare si trova fuori dalla membrana citoplasmatica, è formata da peptidoglicano (formato da acido N-acetil-muramico NAM e N-acetil-glucosammina NAG legati da un legame beta glicosidico). L’unità base è costituita da cinque amminoacidi che hanno caratteristiche particolari, il primo sarà sempre l-alanina, il secondo acido d-glutammico, il terzo l-lisina GRAM + e acido diaminopimelico GRAM - e il quarto e il quinto saranno sempre d-alanina, nei batteri la configurazione sarà anche d giro e l giro ovvero due enantiomeri.

Il terzo amminoacido della catena deve sempre possedere due gruppi amminici perché andrà a formare un legame con il quarto amminoacido dell’altra catena, si chiamerà legame 3-4 o legame trasverso. Quando il batterio deve assemblare la parete cellulare definitiva si andranno a legare gli amminozuccheri alle altre coppie di amminozuccheri. Per formare questa rete si formeranno i legami trasversi che possono avvenire con la catena sottostante o anche soprastante. Nei GRAM + avvengono tutti i legami possibili mentre nei GRAM - c’è qualche legame che non avviene, per questo la parete GRAM - è meno fitta.

Biosintesi del peptidoglicano: La sintesi del peptidoglicano avviene nel citoplasma, il batterio produce i due amminozuccheri e attacca la catena penta peptidica, questa unità viene spedita fuori grazie al vettore bacto fenolo o fenolo che crea un passaggio nella membrana citoplasmatica in modo tale da far uscire l’ultimo mattoncino. Una volta portato fuori il quinto amminoacido si stacca e rende disponibile l’energia che servirà per staccare la parete. PBP sono gli enzimi che uniscono tra loro i mattoncini e si trovano nella parte esterna della membrana citoplasmatica, di questi enzimi se ne conoscono tre tipi. Il legame glicosidico viene effettuato dalle transglicosilasi, che dato che sono a doppia testa, fungono dall’altra parte come trans peptidasi che effettuano il legame trasverso. A staccare il quinto amminoacido della catena ci pensano carbossipeptidasi. Il batterio sintetizza la parete cellulare quando si scinde.

Funzioni della parete cellulare:

• Protezione
• Conferimento della forma
• Responsabile della colorazione di GRAM

Colorazione di Gram

Per prima cosa i microorganismi vengono messi su un vetrino che verrà passato su una fiamma in modo da uccidere i batteri e fissarli nel vetrino.

• Si ricopre il vetrino con il colorante Cristal-violetto/violetto di genziana che si lascerà riposare per un minuto e i batteri si coloreranno di viola, si risciacqua.
• Si aggiunge la soluzione di LUGOL (iodio e potassio ioduro) che andrà a formare un complesso colorato di viola.
• Si aggiunge un decolorante (alcol o acetone) e viene risciacquato sotto l’acqua anche questo. Che succede? I gram + non fanno uscire il colore e resteranno colorati di viola; invece, i gram - lasceranno il viola e per questo sono incolori.
• Si aggiunge la safranina o fucsina che è rossa e si attaccherà ai gram -.

Nella parete cellulare dei GRAM + troviamo gli acidi teicoici, dei polisaccaridi costituiti di glicerolo fosfato e ribitolo fosfato, sono legati al peptidoglicano con la funzione di stabilizzare gli 80 strati di peptidoglicano, rappresentano i principali antigeni di superficie. Nei GRAM + abbiamo gli acidi lipoteicoici che sono ancora più efficaci perché arrivano ad ancorarsi alla membrana citoplasmatica sottostante e sono lunghissimi.

Struttura della cellula batterica

Strutture fondamentali:

• Nucleoide
• Citoplasma
• Membrana citoplasmatica
• Parete cellulare

Strutture secondarie:

Membrana esterna dei GRAM -

Nella membrana dei GRAM - abbiamo nello strato interno, dei fosfolipidi e nello strato esterno troviamo un glicopeptide complesso = lipopolisaccaride LPS. L’LPS è composto da antigene O che è l’antigene somatico polisaccaride costituito da zuccheri semplici disposti in sequenza. Questa sequenza che si ripete è tipica di ogni specie batterica. Al centro dell’LPS abbiamo il core, struttura poco variabile poco importante che serve da connessione. La parte importante è costituita dal lipide A che è fatto da acidi grassi legati ad un dimero di glucosammina fosforilata (gruppi fosfato). Questo lipide A è la parte più pericolosa perché ha le caratteristiche di una tossina, che rilascia effetti sull’ospite. Fino a che la membrana esterna è integra non ci sono problemi, nel momento in cui si disgrega e muore (somministrazione di antibiotici ad esempio) scatena gli effetti tossici sull’ospite.

Funzioni:

• Numero cariche negative che non rendono facili l’avvicinamento dei fagociti e protegge il batterio dalla fagocitosi
• Passaggio dei nutrienti
• Attraverso le porine, consente il passaggio di determinate sostanze

Quando batteri hanno tossine si chiamano esotossine e l’LPS si chiama endotossina.

Cosa comporta il rilascio dell’LPS in quantità eccessive?

• Processo infiammatorio e rilascio di citochine
• Febbre
• CID coagulazione intravasale (coagulazioni al livello venoso)
• Danno endoteliale
• Emorragie che portano a ipotensione, shock e morte

Confronto tra GRAM - e GRAM +

Quelli + terminano col peptidoglicano mentre quelli - hanno un aspetto più frastagliato all’esterno.

Glicocalice/capsula

Il glicocalice o strato mucoso/gelatinoso è un rivestimento polisaccaridico costituito da polimeri di zuccheri semplici; il glicocalice si trova adeso alla superficie esterna della cellula batterica, tra il glicocalice e capsula differisce solo lo spessore. Glicocalice più sottile e con più spazi, la capsula invece sarà spessa e che ricopre tutta la cellula.

Vantaggi?

• Funzione protettiva dall’ambiente esterno soprattutto dai fagociti che non riescono a fagocitarlo grazie allo strato mucoso. Nel momento in cui riesce a fagocitarlo, all’interno del macrofago è possibile che non vengano uccisi perché non vengono riconosciuti e approfittano del macrofago per allontanarsi dal sito di ingresso e creare punti di adesione.
• Crea punti di adesione
• Il glicocalice è fatto di acqua quindi aiuta a resistere all’essiccamento
• Proprietà antigeniche (viene riconosciuta)

Tutte queste proprietà si chiamano fattori di virulenza. Uno dei batteri che produce una capsula molto spessa è la Klebsiella.

Flagelli

Organi di movimento antigeni dei batteri costituiti dalla proteina flagellina e si spostano nei punti nutritivi.

• Atrichi = privi di flagello
• Monotrichi = un flagello ad una estremità
• Lofotrichi = ciuffetto di flagelli a una estremità
• Anfitrichi = due ciuffetti a due estremità
• Peritrichi = ciuffetti in tutta la superficie

Un batterio peritrico è il Proteus che sui terreni di coltura fa delle onde.

Fimbrie/pili/adesine

Sono di natura proteica, costituite da pilina, si ritrovano su tutta la superficie del batterio, sono più corte e sono adesive. Una fimbria particolare è quella che si forma durante la coniugazione batterica, si forma la fimbria adesiva che viene lanciata per acchiappare la cellula batterica, si contrae ed dato che è cava dall’interno del passaggio, viene fatto passare il materiale genetico.

Genetica batterica

Abbiamo un cromosoma di forma circolare, l’unità fondamentale è il gene e l’insieme dei geni è il genoma. Il nucleotide è formato da zucchero, base e gruppo fosfato che fungerà da ponte quando si accoppieranno i due filamenti per formare la doppia elica.

• Genotipo = insieme dei caratteri ereditari, le mutazioni del genotipo non influenzano dall’ambiente e sono ereditarie.
• Fenotipo = insieme delle caratteristiche che derivano dall’interazione del genotipo con l’ambiente, non ereditarie, reversibili, sono da intendersi come un adattamento ambientale.
• Genoma = informazione genetica di un organismo costituito da cromosoma e plasmidi mobili che codificano per informazioni che conferiscono un vantaggio evolutivo, codificati informazioni per antibiotici.

Funzioni dei plasmidi

• Non fanno parte del cromosoma e sono capaci di autoreplicarsi indipendentemente dalla duplicazione del cromosoma, per esempio, si duplicano quando vuole dare una copia plasmidica.
• Contengono informazioni non necessarie alla vita e conferiscono un vantaggio evolutivo.
• Produzione di batteriocine, tossine, emolisine.
• Resistenza ad antibiotici.

Fattore R = plasmide trasferito ad altre cellule batteriche. I plasmidi sono oggetti di ricombinazione e si originano così i batteri multi-resistenti. All’interno del plasmide, la sequenza che codifica per la resistenza degli antibiotici è delimitata all’estremità dai trasposoni.

Trasposoni/elementi trasponibili

Pezzetti di DNA capaci di spostarsi e saltare da un filamento ad un altro con il meccanismo di taglia e cuci chiamato trasposizione. Fanno questo passaggio in corrispondenza di determinate sequenze dove vengono riconosciuti da enzimi chiamati trasposasi.

Come avviene? I trasposoni migrano da un plasmide ad un altro e se questo era un plasmide di resistenza, si origina un altro plasmide di resistenza. Una resistenza agli antibiotici che migra al cromosoma è migrabile in tutta la cellula. Il cromosoma batterico è sempre sottoposto ad un processo evolutivo e in ogni momento devono adattarsi all’ambiente. I processi evolutivi possono avvenire per: mutazioni o per ricombinazioni. Le mutazioni sono cambiamenti ereditari nel DNA e possono essere:

• Spontanee: durante la copia.
• Indotte: causate da agenti mutageni (calore, raggi ultravioletti, agenti alchilanti, agenti intercalanti).
• Puntiformi: una sola base azotata/più basi.
• Silenti: (quando avviene un cambiamento che non provoca un cambiamento nell’amminoacido) missenso (il nuovo codone che codifica per un altro amminoacido e avremo quindi una proteina che si chiamerà aberrante), nonsenso (cambio di una tripletta in un codone di STOP -> UAA, UGA, UAG).
• Transizioni: purina con purina.
• Trasversione: purina con pirimidina.
• Inserzione o delezione: di una singola coppia di basi che provoca uno scivolamento della lettura di queste informazioni e si chiamano frame shift.

Le mutazioni possono essere riparate con un processo che si chiama reversione che può avvenire nello stesso sito o in un sito diverso. Quando vengono riparate le mutazioni, l’organismo che riesce a riparare le mutazioni si chiama revertante.

Ricombinazione

La ricombinazione avviene tra due molecole di DNA differenti, che diventano parte di una stessa unità. Può avvenire tra sequenze omologhe, e quindi comportare una sola sostituzione, oppure tra sequenze non omologhe, e quindi comportare le inserzioni e le delezioni. Nei batteri la ricombinazione coinvolge sempre due cellule, una donatrice e l’altra ricevente, e il trasferimento del materiale genetico può avvenire in tre modalità: trasformazione, trasduzione e coniugazione.

• Trasformazione: la cellula donatrice è una cellula in lisi che ha rilasciato nell’ambiente esterno il suo cromosoma, che viene frammentato. Uno di questi frammenti si fissa sulla superficie della cellula ricevente mediante specifici recettori. La cellula ingerisce parte della membrana in modo tale da permettere l’entrata del frammento.