Tecniche microscopiche e molecolari in anatomia patologica

Tecniche microscopiche e biomolecolari in anatomia patologica

L'ambito di maggiore complessità è quello della patologia neoplastica. La rapidità con cui si accumulano le conoscenze in merito a questo ambito è elevata, la disciplina ha avuto un'accelerazione esponenziale nel produrre conoscenza, ed è molto difficile stare al passo. Nel 1914 Boveri per la prima volta ipotizzò che per le neoplasie ci fosse una base cromosomica, mentre dopo cinquant’anni viene identificata la traslocazione ricorrente del cromosoma Philadelphia. Il primo oncogene è stato identificato nel 1976, nel 1990 è iniziato il progetto genoma umano. Ci sono voluti tredici anni per sequenziare completamente il genoma umano.

Interpretazione e lettura della patologia

Possiamo identificare, in termini di interpretazione e lettura di questa patologia:

• Era pre-genomica in cui le neoplasie e i fattori di rischio sono valutati a livello di popolazione. Oggi l’obiettivo è quello di avere un rischio individuale, non più uno globale. Le neoplasie vengono classificate sulla base della loro morfologia microscopica utilizzando dei criteri istogenetici. Oggi la gran parte delle classificazioni codificate delle neoplasie (blue books WHO) sono di tipo istologico e molecolare.
• Era genomica
• Era post-genomica

Oggi la gran parte delle classificazioni codificanti le neoplasie ha permesso di produrre biomarcatori e molecole utilizzati per prognosi e imaging. I pazienti con le neoplasie in era pre-genomica erano trattati in modo empirico con chemioterapici, sfruttando la diversa capacità di replicazione delle neoplasie, quindi con strategie che tuttavia non si basavano sulle basi biologiche delle singole neoplasie. Negli ultimi 10-15 anni abbiamo assistito a uno shift di paradigmi interpretativi con variazione del focus della ricerca: nell’era pre-genomica si volevano individuare dove si trovassero i geni e come fossero fatti, oggi ci interessa capire come funzionano questi geni tra di loro. Si passa quindi da genomica strutturale a genomica funzionale, da genomica a proteomica. Dalla diagnosi molecolare di uno specifico difetto, oggi si tende a cercare di interpretare quale sia la suscettibilità individuale delle malattie. Servono tecniche che analizzano diversi geni alla volta per fornire una visione globale dei fenomeni biologici. Maggiore interesse anni fa era rivolto ai disordini monogenici, tuttavia gran parte delle patologie clinicamente rilevanti sono malattie multifattoriali.

Complessità genetica delle neoplasie

Le neoplasie sono patologie genetiche molto complesse, sono in gioco eventi di varia natura e portata (riarrangiamenti cromosomici, delezioni interregionali, mutazioni, amplificazioni). Tutti questi eventi richiedono per essere interpretati ed analizzati tecnologie diverse. Negli ultimi anni sono state introdotte nuove tecnologie che consentono di comprendere e valutare la complessità del genoma neoplastico; gli arrays e i sequenziamenti condividono la capacità di produrre un’enormità di informazioni analitiche a basso costo e di nuova generazione fornire informazioni globali quantitative e completamente integrate con le pipeline bioinformatiche.

La complessità della neoplasia consiste anche nel fatto che non si tratta di una malattia stabile nel tempo ma, dal punto di vista genetico, è caratterizzata da un progressivo accumulo di modificazioni. Le neoplasie non nascono come le osserviamo all’inizio clinicamente; il cancro è caratterizzato da modificazioni genetiche ed epigenetiche che nel corso del tempo vengono selezionate seguendo un concetto darwiniano finalizzato a produrre una cellula neoplastica che possa alterare le difese fisiologiche indispensabili per mantenere l’integrità biologica. La gran parte di queste modificazioni ha piccoli effetti; le mutazioni di tipo driver hanno invece effetto dominante. Globalmente, tutte le modificazioni hanno quindi un ruolo nell’incremento della fitness di una cellula tumorale. Le cellule neoplastiche presentano mediamente dalle 50 alle 100 alterazioni somatiche a seconda del tipo di tumore, alcune limitanti nel caso delle mutazioni driver o altre addizionali che contribuiscono poco o affatto e possono essere identificate (passenger).

Quel che definisce la biologia del tumore è il profilo mutazionale completo, il panorama genetico di ogni neoplasia. Il contesto genetico in cui ricerchiamo certe alterazioni e mutazioni contribuisce all’effetto clinico patologico. Devono quindi essere ricostruite immagini sempre più complete dal punto di vista molecolare; il profilo di espressione trascrittomico di una neoplasia descrive quel che è dal punto di vista biologico, decodificare questi dati consente di identificare individualmente le neoplasie e definire strategie personalizzate per il trattamento.

Eterogeneità dei tumori e tecniche di analisi

Le neoplasie non sono composte da cellule tutte uguali. I tumori sono eterogenei, il che ha un’importante implicazione per profilazione e terapie, ma anche per comprendere l’evoluzione temporale delle neoplasie. La risposta iniziale al farmaco e la successiva resistenza, per esempio, è spiegabile dal fatto che la neoplasia è eterogenea dal punto di vista clonale e l’applicazione di una terapia seleziona progressivamente una parte delle cellule di questo tumore che sono resistenti. L’entità e la dimensione del fenomeno dell’eterogeneità tumorale è stata rivelata di recente grazie alla possibilità di disporre di tecniche di sequenziamento che sono in grado di sequenziare molto profondamente i genomi. Hanno la capacità di ottenere su un tessuto decine di migliaia di sequenze di uno stesso tratto di DNA.

Attraverso l’applicazione di tecniche bioinformatiche si può così ricostruire l’assetto filogenetico dei cloni tumorali in una neoplasia. Uno dei tumori in cui è stato fatto questo esercizio per la prima volta è il carcinoma renale a cellule chiare. Grazie al sequenziamento profondo di aree multiple di una stessa neoplasia è stato possibile ricostruire le varie relazioni che esistono tra le cellule che la costituiscono. Ci sono molti tipi di relazioni dal punto di vista evolutivo: evoluzione lineare, evoluzione più ramificata come appunto nel carcinoma renale a cellule chiare, in cui le mutazioni comuni a tutte le cellule (truncali) sono poche (una sola in questo caso). In questo caso, la neoplasia nel corso della sua evoluzione ha progressione ramificata, ogni ramo è caratterizzato dalla presenza di diverse mutazioni driver che si separano dal punto di vista tanto molecolare quanto spaziale (nella neoplasia occupano aree adiacenti). In questo tumore singoli subcloni occupano nicchie spazialmente distinte e funzionalmente diverse nel gioco della selezione clonale singoli cloni possono prevalere nell’evoluzione neoplastica. Alcune mutazioni driver resistenti a determinati farmaci sono presenti su alcune cellule, altre invece rimarranno insensibili alla terapia e prenderanno infine il sopravvento. Questo spiega le ricadute e le metastasi. Esistono diversi modelli di evoluzione tumorale: alcuni sono caratterizzati da profili lineari, altri ramificati simili alla speciazione allopatrica. In alcuni tumori l’evoluzione antagonistica fa sì che i cloni si trovino in competizione tra loro e in altri sono stati invece descritti fenomeni di cooperazione tra i cloni (evoluzione simbiotica).

Storia genetica e evoluzione delle neoplasie

Nel genoma di una cellula tumorale è scritto tutto, la storia della neoplasia può essere ricostruita attraverso il sequenziamento profondo delle lesioni e lo studio delle relazioni clonali all’interno della neoplasia. Un modello è quello dei tumori mammari tripli negativi, negativi a recettori estrogenici ed altri marcatori targettabili. Questi tumori sono stati sequenziati in modo molto profondo e il genoma di queste cellule è stato paragonato ad una sorta di pergamena in cui restano tracce che ci permettono di capire la storia della vita del tumore. Il tempo della vita di una neoplasia non scorre con la stessa velocità a tutti i momenti naturali della malattia; inizialmente è richiesto un tempo fisico molto lungo perché si selezionino alcuni difetti chiave per stabilire mutazioni driver nelle neoplasie (i cloni ancestrali selezionano cellule quiescenti non molto rappresentate ma con elevata capacità di replicazione > staminali). Perché la cellula staminale si trasformi è necessario molto tempo, da questa poi si svilupperanno dei subcloni in un altro largo lasso di tempo atto alla diversificazione clonale.

Un tumore al microscopio, seppure classificato clinicamente come neoplasia precoce, dal punto di vista genetico è già molto diversificato e probabilmente gran parte è dominata da cloni altamente selezionati. Quando queste lesioni arrivano ad essere clinicamente significative allora il tempo accelera molto: cloni dominanti in tumori eterogenei sono caratterizzati da centinaia o migliaia di mutazioni che sono spesso più del set di mutazioni condiviso da tutte le cellule tumorali. Nel corso di evoluzione neoplastica ci sono eventi di diversificazione clonale tardiva caratterizzati dalla capacità di generare eventi genetici catastrofici, in grado di produrre un’instabilità tale da indurre un numero elevatissimo di mutazioni. Sono fenomeni di cromotripsi che spostano la scala temporale quando si realizzano questi eventi. I tumori vanno incontro ad importante accelerazione tanto genetici quanto clinici. Sono questi eventi che riconosciamo nei fenomeni di progressione di una neoplasia (da benigna a maligna, da confinata a metastatica).

È complicato quindi cercare di comprendere a livello del singolo gene, è più semplice quindi fare riferimento a vie biologiche complesse di geni che cooperano per svolgere la stessa funzione. Ad esempio, il carcinoma del pancreas può essere descritto sulla base della deregolazione di 12 pathway multigenici funzionali distinti.

Tecnologie di analisi delle neoplasie

Uno dei primi strumenti utilizzati per descrivere funzionalmente le neoplasie e ricostruire vie di segnale e profili di espressione sono gli arrays. Gli arrays sono collezioni ordinate di frammenti genici, inizialmente erano spot plasmidici su membrana nitrocellulosica ora invece sono oligonucleotidi che vengono litografati su una superficie (chip) di silicio. Su un singolo chip possiamo interrogare centinaia di migliaia di geni diversi; è una delle tecnologie ad oggi più comprensive nello studio delle neoplasie, consente di ottenere una immagine globale del profilo di espressione di una neoplasia. Gli arrays sono un modo di analizzare su larga scala, parallelamente eventi genetici e si possono quindi applicare in modi diversi. Quando gli arrays sono stati per la prima volta applicati alle neoplasie è risultato chiaro che la morfologia da sola non può descrivere in modo completo la biologia dei tumori, hanno aumentato di ordini di grandezza la capacità di interpretare le neoplasie. Nelle leucemie dell’infanzia, nei linfomi, in alcuni sarcomi, hanno rivoluzionato i criteri classificativi aumentando di numero di grandezza i target molecolari che possono essere identificati nella patologia.

I microarrays sono ad oggi l’approccio più comprensivo e produttivo alla quantificazione dell’espressione genica, producono una quantità enorme di dati. Tutti questi metodi non solo accelerano e riducono i costi, ma il vero salto dal punto di vista culturale è il fatto che sono metodi che consentono di ottenere una descrizione globale di un fenomeno biologico complesso. Oggi è l’interpretazione dei dati il fattore limitante: c’è bisogno di integrazione con banche dati ed interfacce bioinformatiche. L’applicazione più semplice e produttiva degli arrays di espressione è quella classificativa: il set di geni espresso o le mutazioni di un tumore sono una immagine molecolare di quel che è la neoplasia, rappresentando quindi delle impronte digitali del tumore ed impiegabili quindi per la classificazione morfologica dei vari tipi di tumori.

Uno dei primi esempi di applicazione degli arrays è stata la classificazione di una classe di linfomi (neoplasie cellule linfatiche non danno massa, sono cellule circolanti) che per anni ha eluso la classificazione morfologica per quanto si sapesse. È una classe eterogenea, ma si trattava di linfomi b-diffusi a grandi cellule con cellule grandi ed atipiche che crescono senza seguire precisa architettura nella proliferazione. L’applicazione degli arrays ha dimostrato che sono classificabili in almeno tre o quattro tipi tumorali diversi a seconda del loro profilo di espressione; la classificazione molecolare è clinicamente rilevante, sono stati visti i marcatori antigenici ed ora è possibile riprodurre questa classificazione molecolare utilizzando un pannello anticorpale con tecniche immunoistochimiche su preparati istologici convenzionali. Lo stesso è stato applicato ad altri tipi di linfomi.

Questo stesso approccio viene applicato in modo indistinto a tutti i tumori. Uno dei primi esempi per i tumori solidi è quello dei tumori mammari. Nel 2004, utilizzando arrays di espressione, è stato possibile descrivere i sottotipi molecolari di questa neoplasia. La profilazione di neoplasie attraverso arrays di espressione ha dei limiti concettuali perché comunque dopo la trascrizione c’è la traduzione, quindi un livello di controllo traslazionale per cui la proteomica aggiunge un livello ulteriore. I dati ottenuti sono complessi, esistono profili di espressione comuni che si riscontrano in diversi tumori. Prima di arrivare ad applicazione clinica dei profili di espressione sono necessari processi rigorosi di validazione attuati sull’istologia; la rilevanza biologica dei diversi livelli di espressione dei geni deve essere accurata.

La quantificazione richiede perciò di applicare delle tipologie di tecnologie diverse, inoltre non basta vedere diversi profili di espressione dei geni, è importante capire quali siano i fenomeni biologici alla base dei diversi profili. In questo senso esistono saggi diversi:

• TMA - sono collezioni di piccoli frammenti di tessuto e consentono di moltiplicare il numero di campioni tumorali che possono essere analizzati su un singolo vetrino con una sola reazione di immunoistochimica.
• FISH analizza pochi target.
• Nanostring consente di ottenere profili di espressione molto quantitativi fino a 700/800 geni. È una tecnologia automatizzata, permette di studiare in modo accurato i profili di espressione con un tempo operatore molto ristretto. Il sistema può essere applicato allo studio dell’espressione, del genoma fisico, delle proteine. Consiste in un sistema di cattura di molecole (DNA, RNA, proteine) su matrice solida usando delle sonde che hanno codice colore: le sonde per le diverse proteine portano una coda formata da una serie di sei fluorocromi che in diversa combinazione identificano la singola molecola catturata. Le molecole vengono legate alla sonda, fissate su un supporto solido, linearizzate e un microscopio è in grado di decifrare la sequenza di fluorocromi di ciascuna sonda per contarle fisicamente. L’analisi può essere a livello di femtomoli (una singola copia per cellula) senza dover ricorrere ad amplificazione (PCR) che introdurrebbe bias di rappresentazione di popolazione di molecole complesse (alla fine della PCR il risultato non è così fedele alla situazione di partenza). È una tecnologia molto sensibile che funziona molto bene, per quanto riguarda lo studio di espressione, anche per acidi nucleici degradati. L’aspetto interessante di nanostring è che può essere utilizzata anche per catturare una proteina o DNA, anche in un singolo esperimento consente in linea di principio di intravedere delle tecnologie di analisi tridimensionale dei fenomeni biologici, si può esplorare la struttura fisica di genoma, trascrittoma e proteoma.
• qRT-PCR
• Array
• DNAsec

Un’altra tecnologia che ha sensibilmente cambiato lo studio delle neoplasie è il next generation sequencing. Si tratta di un complesso di tecnologie di sequenziamento più correttamente definite come sequenziamento massivo parallelo o ad alta produttività o di seconda generazione. Sono tecnologie che hanno rivoluzionato il sequenziamento portandolo a diventare una tecnologia che costa molto poco e può essere applicato alla diagnostica routinaria. Oggi un sequenziatore di seconda generazione può sequenziare interamente il genoma umano in ventiquattro ore ad un costo inferiore ai 1000 dollari, ciò ha richiesto lo sviluppo di conoscenze in numerosi campi, non è una tecnica immaginabile senza l’impiego della PCR o alla disponibilità di risorse biologiche purificate a basso costo o ancora sistemi di rilevazione con fluorescenza. Gli avanzamenti nel campo del sequenziamento nucleotidico definiscono una nuova era nella storia dell’umanità. Nel 1990 si stimava che sequenziare un milione di nucleotidi costasse circa quindici tonnellate d’oro, oggi costa l’equivalente economico di 30g di alluminio.

I sequenziatori di prima generazione possono leggere fino a 900 pb per sequenza ma hanno una resa per giorno che non superava i 2.1 milioni di basi al giorno (meno dello 0.1% del genoma umano). Per sequenziare una volta il genoma umano c’era bisogno di mille giorni, un sequenziatore HiSeq X invece sequenzia frammenti più corti ma ha una resa giornaliera di 50 Gbp che è 16 volte il genoma umano. Ci sono sequenziatori di tutte le dimensioni e costi: i sequenziatori Ion alloggiano diversi tipi di chip e consentono quindi di gestire diversi tipi di esperimenti a seconda di quel che si vuole fare. Se poniamo su una scala logaritmica il numero di pb per esperimento e la lunghezza di sequenziamento si può osservare come il sequenziamento...