Tecniche microscopiche e molecolari in anatomia patologica

Tecniche microscopiche e molecolari in anatomia patologica

Microscopio ottico ed elettronico

Microscopio ottico: Fino a decimi di micrometri.

Microscopio elettronico: Fino a 0,2-0,3 nm, lunghezza d'onda 100.000 volte più piccola della luce, potere risolutivo elevato.

Microscopio a fluorescenza e TEM

Microscopio a fluorescenza: Assorbimento radiazione a 200-400nm.

TEM: Utilizza una fonte di filamento di tungsteno sottovuoto, lenti elettromagnetiche, schermo fluorescente, campioni disidratati, sfrutta moto rettilineo degli elettroni.

Applicazioni patologiche non diagnostiche

• Patologie renali dovute a membrana glomerulare ispessita (normale 300 nm, ispessita 600 nm, sottile 200 nm), se ispessita si ha glomerulocitosi diabetica.
• Patologie dermatologiche come l'istiocitosi x che coinvolge granuli di Birbeck nell'epidermide. La lesione è nel granuloma con cellule di Langherans associate a cellule infiammatorie.
• Patologia ad accumulo lisosomiale evidenziate da lisosomi ipertrofici e danno tissutale.
• Neuropatie con disturbi ai nervi periferici.
• Miopatie sindromi muscolari come la miopatia nemalica caratterizzata da ipoplasia dei muscoli prossimali e facciali.
• Morbo di Whipple: Malassorbimento con macrofagi nei linfonodi.

Diagnosi e strutture coinvolte

• Carcinomi – Desmosomi e tonofibrille.
• Mielomi – RER.
• Melanomi – Melanociti.
• Neoplasie neuro endocrine – Granuli elettrondensi.
• Mesoteliomi – Lunghi microvilli.
• Sarcoma di Ewing – Glicogeno.

Tipologie di prelievo citologico

Poco invasivo, ripetibile, indolore e a basso costo. Usato per prevenzione diagnosi e follow up.

• Citologia esfoliativa: si basa su cellule esfoliate naturalmente come quelle presenti in un espettorato oppure urine.
• Citologia abrasiva: usa metodi di abrasione (scraping) con una scatola come avviene per il pap test, spazzolamento di strutture cave come esofago e bronchi oppure di broncolavaggio o lavaggio peritoniale con soluzione fisiologica.
• Citologia agoaspirata: il prelievo viene fatto tramite un ago aspirato a vuoto anche sotto TAC o ECOGRAFIA.
• Citologia per apposizione: prelievi bioptici durante operazioni chirurgiche e biopsia.

Istologico

Agobiopsia: prelievo di carote di tessuto per masse palpabili con Calibro 21 Gauge.

Biopsia endoscopica: uso di una pinza bioptica montata sulla testa di un endoscopio a fibre ottiche.

Prelievo da tessuto dopo chirurgia che può essere incisionale o escissionale.

Processazione campioni

Fase preanalitica

Vengono etichettate tutte le informazioni del paziente.

Fissazione

Blocca i processi autolitici e putrefattivi tissutali, consente di supportare stress fisici e meccanici, buon grado di riproducibilità e reattività, rapida, rapporto fissativo/campione di 1/20, pH tra 7.3 e 7.4, pressione osmotica di 0,5 oms. I fissativi usati possono essere all’aria, con spray in alcool o liquidi fissativi.

Fissatori coagulanti: etanolo blando, formaldeide, acido acetico annullano attività enzimatica ma non fissano i lipidi.

Fissativi non coagulanti: formalina neutra con tampone 10% forma gruppi di idrossimetile con proteine e altre proteine, proteina e NA e proteine e calcio, ossia legami di cross-linking. La penetrazione della formalina è 12 volte più veloce del binding che è 4 volte più veloce del cross-linking.

Fissazione in M.E.

Si usa glutaraldeide che penetra più rapidamente con cross-linking più veloci e stabili e non fissa i lipidi. Come secondo fissativo per i lipidi viene usato osmio tetrossido. Sottovuoto a 4 gradi per evitare autolisi.

Congelamento

Congelamento con CO₂, gas liquidi o miscele di raffreddamento.

Tempo ischemia a caldo e a freddo

Tempo ischemia a caldo: Tempo che intercorre tra la legatura dell’arteria e prelievo tissutale, in quanto da quel momento il tessuto entra in ipossia.

Tempo di ischemia a freddo: Tempo che intercorre tra il prelievo e la fissazione del tessuto occorre limitare al minimo questa variabile.

Disidratazione

L'acqua viene sostituita con soluzioni a scala crescente di alcool o acetone 70-90-100.

Chiarificazione

Viene inserito un agente miscibile con l’agente di inclusione come lo xilolo per la paraffina e acetone assoluto per le resine.

Infiltrazione e inclusione

Sostituzione con il mezzo di inclusione. Per M.O. viene utilizzata la paraffina, la quale solidifica a temperatura ambiente mentre è liquefatta a 60/70 gradi. Per M.E. vengono usate resine come epon ed araldite, solubili in acetone.

Taglio e colorazione

In M.O. il microtomo taglia da 3 a 20 micrometri in paraffina a rotazione diretta. In M.E. da 0,5 a 2 micrometri, con l’ultramicrotomo si cerca di avere facce parallele tra loro. Tagli ultrafini possono arrivare a 60/80 nm con l’utilizzo di lame di diamante, lo spessore in questo caso viene calcolato in base al colore interferenziale.

Prima della colorazione gli eccessi di paraffina vanno rimossi.

Ematossilina – Eosina: rispettivamente basico e acido legano rispettivamente molecole acide (NA) e basiche (matrice extra-cellulare proteine citosoliche) colorando di blu/viola e rosa.

Istochimiche: per dimostrare la presenza e localizzare particolari target.

• PAS: colora glicogeno e glicoproteine membrane basali e miceti.
• Ziehl-Nielsen: micobatteri della tubercolosi alcool resistenti colore rosso.
• Gomori: differenziazione dei tipi cellulari su strisci di sangue, linfonodi e midollo osseo. Usa eosinato di AZUR per marcare cromatina nucleare e coloranti basici di anilina per nuclei e citoplasmi.
• Papanicolau: consente un ottimo dettaglio della struttura nucleare, cellule squamose rosa, meno mature blu/verde. Consente di visualizzare elementi cellulari unici nelle fasi del ciclo mestruale.

Per microscopia elettronica: acetato di uranile elettivo per acidi nucleici e citrato di piombo per le membrane consentono di evidenziare le zone elettrondense dalle elettronlucide.

Esame intraoperatorio

Viene eseguito durante l’intervento chirurgico e ne indirizza il proseguimento, viene effettuato su un tessuto fresco non congelato. Valuta la presenza e la natura della lesione, si recide sul margine del tessuto tumorale, viene fatta un’iniezione con un colorante blu tracciante che consente di valutare il linfonodo sentinella, in modo da valutare lo stato proliferativo tumorale e il grado di metastatizzazione, il tempo richiesto è di circa 10/15 minuti. Si ha il taglio al criostato a -20 gradi e adesione su un supporto in metallo ricoperto con collante che solidifica a temperatura ambiente, congela in 2 minuti e il taglio è di 4-7mm. La colorazione avviene a temperatura ambiente dopo una breve fissazione con formalina 40% e alcol, rapida colorazione con ematossilina-eosina, e montaggio copri-oggetto.

Interpretazione diagnostica

• Diagnosi di certezza: ci sono tutte le caratteristiche di una precisa malattia.
• Diagnosi di compatibilità: ci sono alcune caratteristiche della malattia ma non tutte.
• Diagnosi di suggestione: ci sono alcune caratteristiche di una malattia che non è quella sospettata.
• Non diagnosi - Diagnosi di risposta descrittiva: ci sono alterazione aspecifiche si descrive solo ciò che si vede.
• Non diagnosi – Diagnosi aspecifica: Il materiale descritto non è sufficiente o è inquinato. Il prelievo va rifatto.

Tissue macroarray

Sono inclusioni con decine o centinaia di piccoli prelievi di singoli campioni tissutali. I vetrini sono preparati con centinaia di singoli campioni tissutali a 4 spot: 3 del tumore e 1 del tessuto normale. Frammenti di 3-6mm posti su un singolo vetrino secondo una disposizione a griglia. Si sceglie con cura l’area tumorale. Le applicazioni possibili vanno dall’immunoistochimica, all’analisi di frequenza delle alterazioni molecolari in differenti tumori. Velocità, facilità d’uso, uniformità, non altera diagnosi ma è poco rappresentativo.

Immunoistochimica

Consente di identificare proteine e glicoproteine, mediante il legame Ag-Ab su cellule e tessuti, gli anticorpi sono molecole proteiche Ig prodotte dalle plasmacellule in grado di legarsi a un determinante antigenico, possono essere monoclonali se sono contro uno specifico determinante antigenico oppure policlonali contro più antigeni. Nel primo caso si ottengono immunizzando un topo e estraendo dalla sua milza linfociti B che vengono poi fatti ibridare con cellule maligne di mieloma, formando un ibridoma che porta alla sintesi intensiva di questi anticorpi che possono essere selezionati su terreno HAT (Hipoxantina-Amminopterina-Timidina) e saggiati con test ELISA, nel secondo caso si ottengono dall’immunizzazione di una pecora, un coniglio o un cavallo e si usa cromatografia per isolarli.

Il legame Ag-Ab deve essere evidenziato mediante marcatori per capire se l’antigene è presente e in che quantità. Vi sono metodi diretti ossia l’anticorpo legato ad Ag e legato anche al fluoroforo, oppure metodi indiretti quando l’anticorpo primario lega Ag e un anticorpo secondario che possiede il fluoroforo. Se la segnalazione avviene mediante fluoroforo parleremo di immunofluorescenza altrimenti di tecniche immunoenzimatiche se si useranno enzimi coloranti.

Vengono usati: Avidina - Biotina – Perossidasi che ha 4 siti di legame ad alta sensibilità; Streptavidina – Biotina – Perossidasi che determina un minor rumore di fondo; e Polimeri del Destrano utilizzati spesso con anticorpi secondari. La presenza di questi composti insieme a perossidasi forma precipitati di colore bruno in presenza di diammino benzene e H₂O₂. I vetrini vengono fatti aderire, si rimuove la paraffina e si idratano le sezioni, si usa il 3% di H₂O₂ per inattivare le perossidasi endogene. Dato che la formalina provoca cross-linking con mascheramento dei siti di legame antigenici per l’alterazione 3D della proteina si usa pepsina/proteasi k e tripsina a 37 gradi con soluzioni di 0,01M a pH 6 e tampone EDTA pH9.

I siti di legame aspecifici possono essere bloccati con 3% siero di albumina bovina BSA. La diluzione dell’anticorpo deve essere ottimale con 1:200 altrimenti si ha l’assenza di background oppure un background troppo forte. Vengono fatti dei lavaggi e si fa contro-colorazione con ematossilina.

Si identificano i falsi positivi testando l’anticorpo su tessuti di cui si conosce quali antigeni sono presenti. Mentre si identificano i falsi negativi confrontando l’anticorpo con un anticorpo specifico per un altro antigene se ci sono omologie allora sarà un falso positivo. Le colorazioni sono ormai automatizzate, è importante però ridurre i tempi di ischemia.

La quantificazione avviene mediante la % di cellule positive su 2000 oppure in maniera semiquantitativa con la frequenza di cellule positive, in combinazione con i dati di intensità della reazione e livelli di cut-off. Le applicazioni sono molto vaste consente di discriminare tra linfomi e carcinomi, linfomi B o T, melanomi o nei, mesoteliomi o adenocarcinomi, identificare origini metastasi; oppure il grado di differenziazione tumorale valutando la presenza di Ki67 mediante l’anticorpo MIB1 indice dello stato proliferativo cellulare che se superiore al 20% è indice di un tumore in stato proliferativo avanzato, identificare prodotti proteico di geni oncogeni o oncosoppressori per la diagnosi o recettori ormonali anormali; valutare l’invasività in base all’espressione delle E-caderine.

Marcatori cellulari

• Epiteliali: citocheratine ossia una famiglia di proteine che costituiscono la maggior parte dei filamenti citoscheletrici associati a adenocarcinoma e carcinoma.
• Muscolari: come la desmina, actina, mioglobina, miogenina in tumori al rabdomiosoma.
• Linfociti: marcatori di superficie cellulari per discriminare clonalità nei linfomi.
• E-caderina, p53.

In microscopia elettronica viene utilizzato l’oro colloidale legato all’anticorpo secondario per evidenziare il legame Ag-Ab.

Ibridazione in situ

Sfrutta l’ibridazione tra acidi nucleici complementari. Rispetto alla IHC gli NA sono le proteine da ricercare. Le sonde sono marcate con un sistema fluorescente o enzimatico. Per la FISH vengono usati tessuti FFPE da biopsie, agoaspirati, cellblock, colture adese su vetrini e fissate. Identificazione di DNA o RNA esogeno. Consente di definire specificatamente il tipo di ceppo. Alterazione DNA e mutazioni geniche.

Cromogenic in situ hybridization [CISH] e Fluorescent in situ hybridization [FISH]

CISH permette di individuare le specifiche sequenze al microscopio ottico in campo chiaro mediante cromogeno.

FISH permette di individuare le sequenze specifiche mediante fluorofori.

Prima di tutto effettuare digestione proteolitica a 80 gradi e rimuovere paraffina con xilolo.

Tipologia delle sonde

Le sonde possono essere locus specifiche: piccole oligonucleotidi riconoscono porzioni corte del cromosoma, si usa per evidenziare aberrazioni che coinvolgono un gene o una parte di esso; centromeriche CEP riconoscono brevi sequenze di DNA ripetitive specifiche per cromosoma; Telomeriche: utili per individuare traslocazioni geniche; Break apart/slip apart signal: sonde progettare per ibridare ai lati opposti del break point di traslocazione per un dato gene ogni volta etichettata con un colore diverso. In cellule normali danno segnali co-localizzati, in cellule con traslocazione i segnali vengono separati e quindi separati. La denaturazione del DNA a 70/90 gradi o a pH elevato, riabbassando la temperatura i 2 filamenti tendono a riappaiarsi a 37 gradi, lavaggi post ibridazione per evitare appaiamenti aspecifici della sonda, rilevazione del segnale al microscopio con z stacking, i segnali confocali lungo l'asse x impilano più immagini, multiplexing, ovvero visualizzando più elementi con cromogeni diversi. Se i nuclei sono troppo digeriti si ha un rumore di fondo che interferisce.

Alterazioni evidenziabili

• Aneusomie: perdita di cromosomi interi con sonde CEPs.
• Delezioni: perdita specifica con sonde regioni specifica.
• Duplicazioni e amplificazioni: sonda referente/regione specifica.
• Traslocazioni: sonde del break point in uno o entrambi i cromosomi.

Ad esempio, l’amplificazione C-ERB-2 relativa al tumore alla mammella mediante il rapporto di fluorescenza tra HER2 E CEP 17 ovvero il suo cromosoma di riferimento. La FISH valuta il numero di copie del protoncogene in relazione all’espressione del cromosoma 17 per distinguere l’amplificazione genica. La traslocazione del gene ALK che interessa il 5/7% dei pazienti con carcinoma polmonare è indicativa di una buona risposta terapeutica con CRIZOTINIB, in questo caso si possono quindi selezionare i pazienti responsivi a specifici trattamenti. La delezione 1p 19q nei tumori cerebrali diagnostica oligodendrogliomi puri con probabile aumento della risposta terapeutica. La FISH utilizza come fluorofori faste red, rodamina, cyanina, spectrum orange/green e controcolorazione DAPI. La CISH utilizza perossidasi come marcatori e controcolorazioni con Giemsa, verde metile, ematossilina ed eosina.

Anticorpi per diagnosi neoplasie

L’analisi IHC può dare info sulla genetica tumorale, screening per triage per ulteriori studi, l’uso di IHC consente di dedurre presenza di fusioni geniche.

• BLC-2: sovra-espresso nel 70/90% dei linfomi follicolari come effetto della traslocazione t(14;18) (p32;q21); è ampiamente espresso nei linfociti ma non nei centri germinali, il test consente di differenziare iperplasie follicolari.
• Cyclin-D1: la ciclina D1 non è normalmente espressa nei linfociti mentre in più del 90% dei linfomi a cellule del mantello è espressa a causa della traslocazione t(11;14) (q13;p32). Permette di individuare mutazioni.
• CTNNB1 nel carcinoma tiroideo indifferenziato, pseudopapillare solido del pancreas adeno-epatocellulare e fibroma desmoide.
• P-53: molto comune in diversi tumori è un evento genetico primario dei carcinomi sierosi e displasie UC – correlate. Può essere dedotta con attività nucleare superiore al 60%, oppure negativa in un contesto di cellule normali. L’anticorpo può individuare il prodotto proteico di una specifica mutazione.
• BRAF: mutazione V600E presente in melanoma, carcinoma papillare della tiroide, adenocarcinoma sieroso, tumore sieroso borderline ovarico, leucemia a cellule pelose e istiocitosi di Langherans. Delezioni e perdita di funzioni come nel caso delle delezioni sui geni MMR i quali formano eterodimeri MLH1-MSH2 che producono una proteina di cui si può verificare la presenza/assenza con l’utilizzo di anticorpi progettati su misura. Amplificazione genetica come 12p 14-15 copie multiple del locus 12p 14-15 sono caratteristiche di tumori linfomatosi o osteosarcomi, i geni amplificati sono MDM2 e CDK4.

Associazioni con virus: HHV8 herpes virus umano 8, gli anticorpi sono contro l’antigene HHV8 e possono dimostrare la sua presenza assenza come PCR E FISH. Correlato al sarcoma di Kaposi, linfoma del versamento primario, linfoma a grandi cellule B che sfocia nella malattia di Castelman. EBV, associato a neoplasie linfoidi, carcinomi linfo-epiteliali. Si trova in modo affidabile con ibridazione per RNA codificato da EBV, l’anticorpo LMP1 contro EBNA2 più affidabile e riflette anche la presenza di immunodeficienza.

Estrazione delle biomolecole

DNA e RNA possono essere estratti ed isolati da qualsiasi materiale, va considerato che l’RNA è altamente più instabile ha un’emivita molto breve lo distinguiamo in ribosomiale, messaggero e di trasferimento, anche in questo caso sono importanti i tempi di ischemia a caldo o a freddo durante l’estrazione. Il miglior RNA o DNA si ottiene congelando l’NA in N₂, va considerato che i cicli di congelamento/disgelo vanno ad influenzare la sua degradazione. L’RNA si inizia a degradare e