Risposte alle domande di Biochimica Alimentare

1.1. Cosa sono le «scleroproteine»?

Le scleroproteine sono un gruppo di proteine insolubili in qualsiasi tipo di solvente in condizioni normali a causa del fatto che esse sono caratterizzate da molecole proteiche tenute insieme da legami molto forti e difficili da rompere come i legami covalenti disolfuro o quelli tipo base di Schiff, cioè dove il legame si forma tra un’aldeide e un amminogruppo. Un esempio di queste proteine sono il collageno, le conchioline e le cheratine, quest’ultime costituiscono la parte resistente della nostra epidermide, unghie e capelli. Per poter modificare la struttura del capello durante la permanente infatti occorre rompere i legami disolfuri con un primo reattivo per poi utilizzare un secondo reattivo per poterli riformare.

2. Cosa si intende per «salting in» e «salting out»?

La forza ionica è una grandezza chimico-fisica che esprime l’intensità del campo elettrico generato dalle cariche. Per spiegare il perché alcune proteine sono solubili in acqua (albumine) mentre altre in una soluzione di acqua e sale (globuline) si costruisce un grafico dove si pone in ascissa la forza ionica e in ordinata la solubilità. Prendendo come esempio le globuline, solubili solo in acqua e sale, si nota che all’inizio la forza ionica è bassa e le loro cariche positive interagiscono con le cariche negative presenti su un’altra globulina. Aggiungendo altro sale l’interazione avverrà tra ioni solvati portandosi dietro un po’ d’acqua e costringendo quindi loro di allontanarsi, per cui l’attrazione di due cariche di segno opposto decresce al crescere del quadrato della loro distanza. Ciò determina una migliore solubilità delle proteine e tale fenomeno è definito salting in.

Aggiungendo troppo sale però, si arriva a una condizione di forza ionica estremamente elevata in quanto il sale in eccesso per potersi solvatare, a causa dell’assenza di acqua libera, sarà costretto a prendere l’acqua di solvatazione che riveste le proteine, e ciò favorirà di nuovo l’attrazione tra le cariche positive e cariche negative delle globuline. Tale fenomeno quindi è definito salting out e determina una diminuzione della solubilità.

A livello alimentare questo processo lo si osserva mettendo il formaggio in una soluzione salina satura per stabilizzarne la struttura allontanando l’acqua presente tra le proteine.

Importante è osservare che la forza ionica non coincide sempre con la molarità del sale utilizzato, ma dipende dalle cariche portate dal sale. Infatti una proteina si scioglie in una soluzione contenente 2 M di cloruro di sodio, mentre non si scioglierà in 2 M di solfato di sodio (la forza ionica si esprime come ½ per la sommatoria delle cariche possedute al quadrato per la concentrazione). Questo perché sia il cloruro che il sodio portano ciascuno una carica, una positiva e una negativa, per cui ½ [(1² + 1²) x 2] = 2 M. Se prendiamo il solfato di sodio invece, lo ione solfato porta due cariche negative, e siccome per ogni molecola di Na₂SO₄ che si scioglie darà due ioni sodio, si avrà che ½ [(2² + 2²) x 2] = 6 M, per cui la forza ionica di una soluzione a pari molarità di uno ione complesso è sufficiente a portare via l’acqua solvatata dalle proteine e pertanto a causare la sua insolubilizzazione.

3. Presentare un esempio di gel stabilizzato da legami a idrogeno

L’esempio più comune di gel stabilizzato da legami idrogeno è la gelatina, dettata dalla conversione del collageno presente nei tessuti animali in qualcosa di solubile in acqua. Si parte da una molecola di collagene che è caratterizzata da legami H tra le triple eliche di tropocollageno, e quando una soluzione contenente questa proteina viene portata ad alte temperature, o meglio fatta bollire, questi legami H si rompono ed ottengo un brodo liquido in cui l’acqua va a competere. Quando questo brodo viene lasciato raffreddare viene diminuita la mobilità dell’acqua con conseguente formazione di un reticolo tridimensionale con disposizione casuale di legami a idrogeno tra gli NH e CO delle molecole del collageno. Il motivo della disposizione casuale del legami a idrogeno è spiegato dal fatto che la tripla elica del collagene è un processo laborioso da ottenere per cui è praticamente impossibile riformare la struttura nativa. Questo processo di formazione della gelatina solida a partire da brodo è reversibile, cioè posso riformare il brodo scaldando la gelatina ottenuta.

Situazione analoga si può attribuirla all’amido, costituito da amilosio (polimero lineare del glucosio) e amilopectina (polimero ramificato del glucosio). Le regioni amorfe dei granuli di amido sono prevalentemente costituite da amilosio e da parte delle catene di amilopectina, mentre le regioni cristalline sono costituite dalle catene laterali di amilopectina, ordinate in direzioni centro-periferia: questa distribuzione conferisce quindi al granulo di amido la sua struttura propriamente semicristallina. La presenza nell’amido sia di legami covalenti che di legami a H, fa sì che l’intera molecola sia insolubile a bassa temperatura. Anche in questo caso però, se lo si scalda in presenza di acqua, si determina la rottura dei legami a H avendo così la trasformazione dell’amido in una struttura che incorpora acqua e che quindi solvata amido.

4. Perché la solubilità di proteine è minima al loro punto isoelettrico?

Il punto isoelettrico per definizione è il valore di pH al quale la proteina ha una carica netta pari a zero. Quando le proteine si trovano in questa condizione in realtà non sono prive di carica, bensì il numero di cariche positive eguaglia quelle negative, e quindi la proteina ha la minima capacità di trattenere acqua, formando così un reticolo proteico insolubile in acqua. Allontanandomi da questi valori di pH la proteina varia la sua solubilità ed in particolare quest’ultima aumenta perché inizieranno ad essere presenti delle cariche e questo fa sì che le varie molecole proteiche inizino a respingersi e le loro interazioni saranno più limitate. Infatti il fatto che una proteina interagisca con acqua piuttosto che con altre proteine dipende oltre che allo stato della carica presente, anche alla loro solubilità in funzione del pH, e ovviamente anche alla solubilità della composizione del mezzo disperdente.

Un esempio importante è lo yogurt: nel latte vengono immessi dei microrganismi e la temperatura viene portata a 37 gradi. Questi microrganismi si cibano del lattosio producendo acido lattico, il quale abbassa notevolmente il pH (quello di partenza era di 6,2). Quando questo valore raggiunge 4,6, cioè il valore del punto isoelettrico delle caseine, esse presentano carica netta pari a 0 e perciò tenderanno a insolubilizzarsi e ad associarsi tra di loro a formare una massa che rappresenta lo yogurt. Per evitare però che il siero si precipiti dalle caseine, è importante evitare di arrivare esattamente a pH 4,6, ma di arrivare a pH leggermente più alto per far sì che le caseine conservino un poco di carica per trattenere l’acqua. Oppure si può anche scaldare in una delle fasi del processo per permettere la formazione di legami disolfuro tra la k-caseina e la betalattoglobulina. La prima è una delle proteine che costituisce la micella di caseina, mentre la seconda è una sieroproteina, quindi presente nel siero del latte.

5. Presentare un esempio di gel stabilizzato da legami disolfuro

Un esempio importante di gel stabilizzato da legami disolfuro è l’uovo. Questo tipo di stabilizzazione infatti permette il rassodamento dell’uovo a uovo sodo e la formazione di una struttura reticolare nel caso degli impasti da forno. In particolare circa la metà delle proteine dell’albume sono rappresentate dall’ovoalbumina, la quale è poco glicosilata e presenta una netta distinzione tra la regione polare all’esterno e la regione apolare all’interno, caratterizzata dalla presenza di 3 cisteine libere e 2 impegnate in un legame disolfuro. Denaturando la struttura dell’ovoalbumina con la temperatura, ciò che avviene è la simultanea esposizione dei siti idrofobici e reazioni di scambio di disolfuro intermolecola.

6. Lega più acqua una proteina che contiene 20 Glu e 80 Asn nella sua sequenza, oppure una che contiene 20 Asn e 80 Glu?

Lega più acqua la proteina con 80 Glu e 20 Asn perché il glutammato è più polare data la presenza di un gruppo carbossilico nella sua catena laterale, mentre l’Asn è un amminoacido polare privo di carica e caratterizzato dalla presenza di un gruppo amminico del tipo H₂N nella catena laterale. La presenza del gruppo COOH fa sì che la molecola porti una carica negativa e così riesca ad interagire meglio con l’acqua e per questo è anche più solubile.

7. Presentare un esempio di gel stabilizzato da ioni Ca²⁺

La presenza di Ca²⁺ su una proteina contribuisce a dare stabilità alla molecola perché crea delle interazioni di tipo ionico ed elettrostatico interagendo con le abbondanti cariche negative, essendo carico positivamente (++).

Questo tipo di interazione è fondamentale per la produzione del tofu e dello yogurt. Per quanto riguarda il tofu, si parte da un estratto proteico di globuline di soia al quale si aggiunge del calcio. Questo va ad interagire con le abbondanti cariche negative presenti nelle globuline di soia: infatti oltre ad avere un contenuto modesto di glutammina e asparagina, queste proteine sono molto ricche in amminoacidi acidi come glutammato e aspartato e a pH a cui si agisce essi sono dissociati, per cui il calcio si dispone a ponte tra due cariche negative creando un doppio legame ionico, creando quindi un reticolo tridimensionale stabilizzato da interazioni elettrostatiche che incorpora al suo interno acqua (tale reticolo non è sensibile al pH per cui il tofu mantiene il suo aspetto anche se viene fritto).

Per quanto riguarda lo yogurt invece, è importante spiegare che la principale proteina presente nel latte (30 g/L) di diversi mammiferi è la caseina, la quale è costituita a sua volta da diverse proteine: alfa s-1 caseina, alfa s-2 caseina, beta-caseina, k-caseina. In particolare le prime tre sono ricche in residui di serina il cui ossidrile alcolico è legato permanentemente con un legame estere con uno ione fosfato, perciò i residui fosforilati, portando con sé cariche negative, permettono allo ione calcio di disporsi a ponte. Tutte queste proteine sono in grado di organizzarsi tra di loro formando degli aggregati permanenti e stabili, che prendono il nome di micelle di caseina le cui dimensioni dipendono dal tipo di latte (nel latte di vacca hanno diametri di 47 nm, mentre in quello di bufala di 104 nm). Queste micelle quindi, grosse ma sufficientemente piccole da essere tenute in soluzione, sono tenute insieme da interazioni idrofobiche che tengono unite ciascuna submicella, e da interazioni elettrostatiche grazie appunto alla presenza delle serine fosforilate nella alfa s1/2 e nella beta-caseina, i quali legano ioni calcio messi a unire le diverse submicelle. Per produrre lo yogurt si acidifica il latte portandolo ad un pH vicino al punto isoelettrico medio delle caseine ottenendo così una diminuzione della frazione delle cariche negative ed un aumento di quelle positive, e permettendo alle micelle di caseine di interagire tra di loro formando un gel stabilizzato dall’espansione di questo reticolo con interazioni ioniche, lo yogurt.

8. Quali caratteristiche strutturali o compositive fanno sì che le gliadine siano solubili solo in alcoli?

Le gliadine sono le classiche proteine di riserva nei cereali e fanno parte della famiglia delle prolamine, cioè delle proteine solubili in alcol etilico al 60-70% o in alcol isopropilico al 40%. Questo succede perché sono proteine molto apolari, e gli unici amminoacidi polari sono la glutammina e l’asparagina. La presenza di queste anziché di glutammato e aspartato è molto vantaggioso poiché è un metodo comodo per depositare proteine di riserva in quanto nella glutammina l’azoto pesa 14, mentre se aggiungessimo acido glutammico l’ossigeno peserebbe 16: l’azoto serve per fare crescere la pianta e quindi è importante, mentre l’ossigeno è facilmente ricavabile, per questo la glutammina è vantaggiosa poiché risparmiando sul peso si riesce a mettere via il doppio della quantità di azoto. Inoltre il glutammato lega moltissima acqua, mentre la glutammina meno, per cui è possibile disidratare la parte proteica di un seme. Per solubilizzarle bisogna diminuire la spinta entropica dell’acqua di spingerle le une alle altre, e quindi bisogna sostituire l’acqua con un solvente meno polare, oppure posso distruggere la struttura dell’acqua utilizzando i famosi caotropi come urea, oppure una combinazione di temperatura o detergenti.

9. Come mai alcuni ioni hanno azione destrutturante?

Gli ioni sono molecole cariche positivamente, cationi, o negativamente, anioni, che vengono introdotti in una soluzione con lo scopo di aumentare la forza ionica cioè aumentare l’intensità del campo elettrico generato dalle cariche. In presenza per esempio di una soluzione 0,5 M di NaCl, la proteina si scioglie conservando la sua struttura nativa, ma in presenza di una soluzione di perclorato di sodio (NaClO₄), la proteina si scioglie ottenendo anche una forma denaturata. Questa differenza si verifica perché si possono distinguere sali con una funzione strutturante, e sali con una funzione destrutturante. Essi interagiscono con l’acqua in modo diverso, infatti più sono solvatati e più rimarranno sulla superficie della proteina, mentre più sono piccoli meno saranno solvatati e riusciranno a penetrare all’interno della proteina disturbando le interazioni elettrostatiche all’interno della struttura terziaria indebolendo la struttura della proteine. A tal proposito esiste una scala, la scala di Hofmeister, in cui sono ordinati gli anioni e i cationi che non penetrano la proteina “liotropi”, e quelli che la penetrano “lipotropi o caotropi”. Per quanto riguarda i cationi, quelli “meno fastidiosi” sono di grosse dimensioni come il rubidio, il cesio e il potassio, mentre quelli “più fastidiosi” sono il litio e l’ammonio. Per quanto riguarda gli anioni, quelli “meno fastidiosi” sono il solfato e il fosfato, mentre quelli che lipotropi sono tiocianato e il perclorato.

10. Perché una eccessiva acidificazione dello yogurt porta ad una separazione di fasi?

Nella produzione dello yogurt vengono aggiunti dei microrganismi che prendono il nome di batteri lattici, Streptococcus thermophilus e Lactobacillus bulgaricus, che nutrendosi del lattosio liberano come prodotto del metabolismo l’acido lattico che abbassa il pH. L’eccessiva acidificazione fino al punto isoelettrico delle caseine (4,6) porterebbe alla eguaglianza delle cariche positive e delle cariche negative, e quindi a una minore capacità di trattenere l’acqua e perciò le caseine si insolubilizzerebbero. Infatti arrivare esattamente a pH 4,6 porterebbe alla separazione nelle due fasi, del siero e delle caseine (effetto sineresi), perciò un’accortezza importante è quello di arrivare a un pH leggermente più alto del PI delle caseine, in modo da far conservare ad esse un poco di carica affinché possano interagire con l’acqua. Lo yogurt inoltre non è un gel compatto, in quanto basta inserire un cucchiaio per spaccarlo, per questo per renderlo più compatto si può riscaldarlo in una delle fasi di produzione per favorire i legami di disolfuro tra la k-caseina e la betalattoglobulina (rispettivamente due delle proteine che costituiscono la caseina e il siero).

11. Quale componente proteica della caseina è glicosilata, e in quale regione?

La principale proteina nel latte di vari mammiferi è la caseina (30 g/L), a sua volta costituita da diverse proteine: si distinguono la alfa s-1 caseina (12-15 g/L), la alfa s-2 caseina (3-4 g/L), la beta caseina (9-11 g/L) e la k-caseina (3-4 g/L). L’alfa s-1 caseina è caratterizzata dalla presenza di un congruo numero di proline, un imminoacido che impedisce alla proteina di assumere una struttura secondaria. Infatti l’alfa s-1 caseina è tipicamente una IDP, proteina intrinsecamente priva di struttura terziaria organizzata. Quando la proteina priva di struttura transita nel tratto digerente, rende più agevole intervenire con le proteasi e recuperare per via idrolitica gli amminoacidi essenziali per il nostro corpo. È inoltre caratterizzata dalla presenza di residui idrofobici e di serine il cui ossidrile è legato permanentemente con un legame estere con uno ione fosfato: questa è una modificazione post traduzionale nella ghiandola mammaria che porta sempre cariche negative addizionale alla proteina. L’alfa s-2 caseina è più strutturata della prima poiché ha un minore numero di residui di prolina ed è caratterizzata da congruo numero di residui di serina fosforilati. La beta-caseina è la più ricca in prolina, e presenta un modesto contenuto in amminoacidi idrofobici e di siti di fosforilazione concentrati nei primi 26 amminoacidi. La k-caseina è l’unica proteina che contiene residui di cisteina, in particolare 2: questo è il motivo per il quale i nostri bisnonni erano soliti mangiare polenta e latte. Il latte è ricco di cisteina e povero in lisina, mentre la polenta il contrario, questo permetteva una corretta introduzione di amminoacidi essenziali. La k-caseina presenta una forma modificata del glutammato in posizione 2, e una dissimetria nella distribuzione dei residui idrofobici. Infatti sono concentrati nella regione N terminale, mentre nella regione C terminale sono concentrati residui di serina e treonina a cui sono attaccati degli zuccheri, conferendo quindi dall’amminoacido 106 al 166 una struttura polare. Quindi la k-caseina è idrofilica.

2.1. Qual è la frazione di ligando associata ad una proteina, data u