Appunti di microbiologia

1° Lezione

Introduzione: la locomozione microbica

La microbiologia è la scienza degli esseri viventi microscopici, cioè i microrganismi (alcuni patogeni per l’uomo, altri innocui). Alcuni microbi patogeni per l’uomo possono non esserlo per gli animali e viceversa. Abbiamo due genomi: il nostro e quello dei microbi che albergano nel nostro corpo (microbioma o microbiota). Esempio di microrganismi non nocivi per l’uomo: la nostra flora batterica intestinale comprende batteri detti commensali perché possono vivere senza recarci danni.

Presenti nell’apparato riproduttore, intestino, bocca. Polmoni, sangue e cervello devono essere sterili. Se sono presenti microbi in questi ultimi, essi sono sicuramente patogeni. Normalmente veniamo colonizzati da microbi.

I microrganismi

Questa classe di organismi comprende una grande quantità di esseri viventi; inizialmente si pensava che facessero parte di questo gruppo solo cellule procariotiche, la maggior parte delle quali portano malattie. Oggi si sa che il gruppo dei microrganismi comprende sia cellule procariotiche che cellule eucariotiche, capaci di vivere autonomamente. La cellula eucariotica animale non riesce mai a vivere autonomamente né in coltura né in vitro, mentre le cellule procariotiche ed eucariotiche unicellulari vivono autonomamente.

La microbiologia è una scienza che studia microrganismi come:

• Batteri: cellule procariotiche, studiate dalla batteriologia.
• Protozoi: vengono definiti parassiti, sono studiati dalla parassitologia. Sono cellule eucariotiche e un esempio importante di questa classe ci è dato dal patogeno della malaria.
• Alghe: cellule eucariotiche che esistono in natura come singola cellula (non di interesse umano).
• Funghi: cellule eucariotiche che esistono in natura come singola cellula. Sono eucarioti studiati dalla micologia. I funghi sono causa di molte malattie cutanee, altri invece, se inalati, causano malattie sistemiche (i funghi sono pluricellulari, ma presa una cellula di lievito singola essa è unicellulare).
• Virus: studiati dalla virologia, non sono né cellule procariotiche né eucariotiche bensì strutture acellulari in quanto non presentano un doppio strato fosfolipidico.

Essi sono accomunati dal fatto che sono unicellulari e capaci di vita autonoma. Sono capaci di creare malattie nell’uomo.

I microbi possono essere trovati ovunque sulla terra, non esiste distretto sulla terra che non possa essere colonizzato da essi. Essi sono assenti soltanto in zone sterili degli esseri viventi, come il sangue o il cervello. Abbiamo migliaia di tipi di microrganismi: alcuni patogeni, altri utili, alcuni addirittura indispensabili.

Dove vivono?

Ovunque:

• Suolo
• H 02
• Aria
• Corpo umano
• Corpo animale
• Piante

Tutti i batteri, che fanno parte della flora batterica intestinale, indispensabili perché ci aiutano a digerire e poi perché producono sostanze che noi non siamo in grado di produrre (c’è una perfetta simbiosi).

Troviamo specie diverse in zone diverse che si adattano all’ambiente in cui vivono. Ci sono organismi indispensabili per la degradazione del petrolio grazie a particolari enzimi che producono.

Dei microbi si studia tutto, ne studiamo:

• La morfologia (forma dei batteri).
• La fisiologia.
• La distribuzione: cioè dove è più rappresentato, e questa in particolare aiuta a capire su che scala si sta espandendo/si concentra un’epidemia.
• La genetica.
• La tassonomia: scienza che classifica gerarchicamente i batteri, fondamentale per identificare in maniera univoca i vari microbi.
• L’evoluzione: come nel corso del tempo i batteri che non si sono estinti, sono cambiati.

Che cosa ha portato un grandissimo cambiamento di vedute nella scienza?

I microrganismi sono stati molto utilizzati nelle catene biosintetiche, genetica molecolare e metabolismo cellulare. Essi sono ottimi modelli per le sperimentazioni.

La microbiologia medica studia ovviamente solo i batteri che entrano concretamente in contatto con l’uomo, siano essi commensali o patogeni. Ovviamente quelli più studiati sono i patogeni, che vengono studiati nella loro totalità e completezza, mentre i commensali molto di meno (alcuni non vengono nemmeno presi in considerazione, perché sarebbe uno studio inutile).

Le catene biosintetiche, la genetica molecolare e i fenomeni di metabolismo cellulare di tutti i microbi sono molto simili a quelli degli eucarioti complessi, ma essi sono più semplici. Infatti molti processi, come la glicolisi o la trascrizione, sono stati studiati prima sui microbi e poi sugli eucarioti.

Tutti i tipi di microrganismi vengono utilizzati in svariati settori, in particolare in quello agricolo e in quello industriale. I microrganismi sono indispensabili nell’agricoltura:

• Conservazione e aumento fertilità del suolo.
• Industrie, processi di fermentazione (produzione di vino, birra, formaggio, gorgonzola, lievito di pane e vaccini, sfruttando le potenzialità degli organismi).

Anche in ambito farmaceutico i microbi rivestono una certa importanza, in particolare:

• Antibiotici: formati anche attraverso batteri e funghi (oltre che per sintesi chimica), un esempio pratico ci è dato dal fungo Penicillium grazie al quale si può produrre la penicillina.
• Vitamine: prodotte da batteri.
• Vaccini: microbi inattivati che introdotti nel paziente causano una risposta immunitaria senza però causare l’insorgere della patologia.
• Amminoacidi.
• Enzimi.
• Acido citrico.

Anche le bevande alcoliche (vino, birra) vengono prodotte sfruttando batteri, in particolare utilizzando un loro processo metabolico detto fermentazione.

Molte di queste sostanze non siamo in grado di produrle autonomamente per cui dobbiamo avere il supporto dei microrganismi; altre volte ce li dobbiamo ricavare dall’esterno con l’alimentazione oppure con i farmaci.

Caratteristiche microrganismi

Ciò che accomuna la maggior parte dei microbi è rappresentato da questi fattori, che non ritroviamo negli eucarioti:

• Rapida moltiplicazione (20 min).
• Versatilità metabolica.
• Capacità di crescere in terreni di coltura semplici.
• L’omogeneità.
• Subire modificazioni genetiche sperimentalmente.
• Essere molti miliardi di individui in pochissimo spazio.
• Generare mutanti, costruiti nei laboratori perché risultano utili per svariati esperimenti. Un esempio ci è dato dal virus dell’influenza aviaria, era un virus dei polli che, grazie ad una piccola mutazione, è diventato patogeno per l’uomo.

La microbiologia studia le cose microscopiche che siano al tempo stesso viventi e capaci di vivere in autonomia (cioè come forme di vita unicellulari).

Microscopi

Una piccolissima cellula procariotica è microscopica ma possiede molte caratteristiche. I microrganismi vengono impiegati in molti laboratori biotecnologici per ogni tipo di ricerca. Le grandezze trattate dalla microbiologia sono microscopiche, e per visualizzarle a pieno questa scienza utilizza i microscopi.

Il microscopio, scoperto nel ‘900, ha permesso di poter identificare ciò che era responsabile di eventuali malattie. Prima del microscopio elettronico si supponeva l’esistenza di questa classe di organismi, ma la certezza vera e propria è avvenuta intorno al 1700 con l’avvento del microscopio. Con microscopi particolari non solo si vede la cellula ma anche tutte le strutture presenti al suo interno.

Abbiamo diversi tipi di microscopi:

• Microscopi ottici sia a luce visibile che ultravioletta (i più semplici).
• Microscopi elettronici e a luce confocale (più avanzati che vengono utilizzati per evidenziare dettagli specifici).

I vetrini di agenti patogeni vengono analizzati con particolari accortezze a causa dei possibili rischi di contagio.

I batteri hanno dimensioni dell’ordine del micrometro, o millesimo di millimetro, e pertanto possono essere visti solo mediante l’uso del microscopio.

Dal punto di vista della grandezza, partendo dal più grande al più piccolo possiamo suddividere i microbi in:

• Protozoi: studiati nella parassitologia, sono microrganismi ma sono eucarioti (es. malaria).
• Lieviti: si studiano chimicamente in dermatologia (es. funghi, macchie sulla pelle). I funghi innocui e fondamentali per l’uomo sono presenti nella birra, nei formaggi, pane ecc…
• Batteri: cellule procariotiche (non hanno un nucleo) osservabili col microscopio ottico ed elettronico.
• Virus: un po’ improprio dire microrganismi perché è un parassita, non autonomo nella riproduzione. Sono materiale acellulare, non hanno membrana ma un capside rivestito da proteine.

La grandezza non è proporzionale alla patogenicità (non c’è rapporto tra grandezza virus e entità del danno), possiamo avere microbi grandi e poco patogeni come microbi piccoli ma molto patogeni e viceversa. Ad esempio il virus della poliomielite è il più piccolo ma dannoso. La patogenicità è determinata solo dal meccanismo molecolare attraverso il quale il microbo attacca.

Per tradizione, i microbi sono stati descritti come organismi a vita libera di dimensioni talmente piccole da poter essere visibili soltanto con il microscopio. Tuttavia, alcuni sono sufficientemente grandi da essere osservati ad occhio nudo. I batteri più piccoli sono di appena 0,2 micrometri mentre i grossi batteri e protozoi possono raggiungere la lunghezza di 1 mm e più.

μm
1 mm (10 m) 0,1 mm 0,01 mm 1 nm 1 A (10 m)
0, μm 0,0 μm
-3 -10
Protozoi, lieviti, batteri Virus animali Macromolecole Atomi
Occhio nudo -----------→ 10 m 10 m-6 -9
Microscopio ottico a luce visibile -------------------------→
Microscopio ottico a luce UV --------------------------------------------------→
Microscopio elettronico/confocale --------------------------------------→

Forma dei batteri

I batteri hanno una morfologia abbastanza semplice e ben definita, in base alla quale vengono distinti in cocchi, bacilli, vibrioni, spirilli, a seconda che la cellula sia sferica, a bastoncino, a virgola, a spirale.

Cocchi (tondi e sferici): hanno forma rotondeggiante.

Bacillo (bastoncini): forma cilindrica.

Vibrione (a virgole): aspetto di una virgola (vibrio colera, forme più comuni di cellule batteriche).

Spirillo (bacillo ondulato): forma ibrida tra bacillo e vibrione (spirochete, sifilide-treponema).

Queste forme vengono conferite dalla membrana cellulare, in particolare dal peptidoglicano, il costituente quasi principale della parete dei Gram+.

Questi batteri hanno comunque caratteristiche comuni:

• L’interno è completamente sprovvisto di membrana.
• Mancano i cloroplasti, i ribosomi sono più piccoli in dimensioni rispetto alle cellule eucariotiche.
• Tutti presentano la parete cellulare, peculiarità dei microrganismi in generale insieme alle piante.

In genere i vibrioni e gli spirilli sono i più patogeni, mentre i cocchi e i bacilli sono ampiamente rappresentati nei batteri ambientali.

I batteri sono organismi unicellulari e possono esistere come cellule singole o come aggregati di cellule. Infatti, troviamo per lo più cellule singole nel mondo microbico, ed è proprio questa la particolarità perché le cellule singole hanno possibilità di avere vita autonoma e di essere considerate entità a sé stanti. Tuttavia molto spesso possiamo notare delle aggregazioni batteriche pluricellulari mediate dalle adesine.

Le possibili associazioni sono:

• Diplococchi, unione di due cellule di cocco (due cellule sferiche) assumono la forma di un chicco di caffè.
• Streptococchi (se sono in fila), unione di più cocchi (di più cellule sferiche) assumono la forma di una collana di perle corta.

La loro forma originale è sempre quella del cocco.

Alcuni cocchi si dividono sempre secondo due piani ortogonali, formando superfici piane di più cellule. Altri cocchi si dividono secondo tre piani ortogonali e formano raggruppamenti cubici caratteristici della sarcina. Se invece la divisione avviene senza un ordine, si ha la formazione di grappoli di cellule, caratteristica degli stafilococchi. Se più bacilli restano associati a formare delle catene, sono detti streptobacilli.

• Sarcina, aggregazione di cocchi a gruppi su tre piani ortogonali.
• Stafilococchi, forma tridimensionale organizzata a grappolo d’uva (aggregazioni cellulare diverse nei batteri).
• Streptobacilli, organizzazione dei bacilli disposti in fila.

Postulati di Koch

Come si fa a determinare un microrganismo e come si fa a vedere se è portatore di una malattia? La materia vivente nasce solo da materia vivente e esiste per generazione spontanea?

Per anni si pensava che la generazione spontanea esistesse veramente. Molti scienziati hanno sostenuto che alcuni organismi possono generarsi spontaneamente dalla materia non vivente, citando come esempio le larve e le mosche che si generano sulla carne in decomposizione.

Qualunque esperimento ha sempre bisogno di un valido controllo.

La riproducibilità dell’esperimento è stata molto accreditata da Robert Koch, scienziato che creò dei postulati validi ancora oggi e scoprì il bacillo del carbonchio, oggi noto come bacillo dell’antrace (causato da una tossina).

Postulati di Koch

Sono dei criteri nati nel 1876 validi ancora oggi, che hanno lo scopo di stabilire la relazione causa-effetto che lega un microrganismo ad una malattia.

1° postulato: il microrganismo si trova in tutti i casi della malattia e ha lesioni tipiche (ossia si deve riscontrare in tutti i pazienti). Un esempio ci è dato dalla varicella, che crea le pustole in tutti gli infetti, oppure dalla polmonite, che provoca forte dolore sternale, tosse e con la radiografia deve essere visibile una zona opaca. (1° topo)

2° postulato: il responsabile isolato, coltivato e inoculato riproduce la malattia negli animali sensibili, cioè quelli che passano le barriere di specie (animali da esperimento) (2° topo).

N.B.: le barriere di specie sono determinanti anche nelle sperimentazioni cliniche, infatti i trial clinici prima interessano gli animali e poi gli uomini.

3° postulato: reisolarlo in animali infettati sperimentalmente e metterlo in coltura per essere sicuri che sia lo stesso che avevamo estratto al punto 1. (3° topo, che a differenza degli altri due non viene inoculato con l’agente infettivo e serve da controllo all’esperimento che avviene in condizioni ideali).

Applichiamo questi postulati ad un esperimento: abbiamo un topo morto e pensiamo sia morto per una malattia infettiva, ma bisogna dimostrarlo. Se un nostro topo da laboratorio muore, presumibilmente per una malattia infettiva, posso analizzare il suo sangue isolandolo e ponendolo su delle piastre ad hoc, e se trovo un sospetto agente patogeno, lo faccio crescere in coltura. In un secondo momento, prendo le colonie e reinoculo questo microrganismo in un altro topo, che successivamente isoliamo per vedere se presenta le stesse caratteristiche delle colonie precedenti; questo topo quindi può avere lo stesso iter diagnostico del primo topo, e ciò aumenterebbe le possibilità che il nostro microrganismo sia l’agente scatenante la malattia, ma la certezza ci è data solo dalla morte del secondo topo e dal ritrovare poi nel suo sangue lo stesso microrganismo.

Affinché questo risultato sia valido al 100% dobbiamo controllare in contemporanea che questo esperimento sia giusto, per cui dobbiamo prendere un animale sano, isolare il sangue e accertarci che non presenti alcun tipo di microrganismo. Il secondo topo, prima che gli venisse inoculato il microbo, non doveva presentare il microrganismo nel sangue e il microrganismo trovato nel secondo topo doveva sopravvivere se messo in coltura.

Cosa compone un microrganismo?

E. coli rappresenta l’esempio della cellula più grande del mondo dei microrganismi (diametro approssimato o lunghezza x lunghezza 1300x14000), rispetto ai Rickettsie (47s) e ai virus che causano malattie gravi come l’influenza (8s) e la poliomielite (27, piccolissima dimensione ma grave la sua infezione).

Ci sono 6 elementi indispensabili per i microrganismi:

• Ossigeno.
• Idrogeno.
• Fosforo.
• Zolfo.
• Carbonio.
• Azoto.

Questi elementi sono quelli più abbondanti in natura perché sono i costituenti principali degli amminoacidi, delle basi azotate e quindi degli acidi nucleici, ma anche dei carboidrati. Si trovano nelle molecole biologiche.

• Calcio.
• Sodio.
• Magnesio.

Queste sostanze sono presenti in tracce.

Le diete devono essere equilibrate per garantirci il giusto apporto di questi 6 elementi.

I batteri

I batteri sono le più piccole e versatili cellule dotate di vita autonoma. Nell’ampio mondo dei microrganismi il fatto di essere procarioti permette loro di possedere la minima dimensione possibile, per un microrganismo dotato di vita autonoma. A causa delle loro ridotte dimensioni e del fatto che sono quasi tutti privi di colorazione, richiedono l’uso di coloranti per poter essere visualizzati al microscopio ottico o elettronico.

Qualunque sia la complessità della forma cellulare, la dimensione di 1 μm non potrebbe ospitare tutti gli organelli intracellulari (mitocondri, nucleo, apparato del Golgi, lisosomi e reticolo endoplasmatico) in una cellula che da sola è grande in media quanto un mitocondrio. L’unica soluzione può essere rappresentata dalla cellula procariotica batterica dove le strutture principali risiedono sia nei rivestimenti esterni multistratificati che nelle appendici, nel citoplasma e nel core interno costituito dal nucleoide.

Colorazione di Gram

Nel 1884 il medico danese Hans Joachim Christian Gram divise i batteri in Gram-positivi e Gram-negativi, grazie ad un esame di laboratorio da lui chiamato