Appunti microbiologia

Microbiologia

Concetti generali

La microbiologia è la scienza che studia i microrganismi, esseri viventi di piccolissime dimensioni, non osservabili ad occhio nudo. Di microrganismi fanno parte i batteri, i funghi microscopici, i protozoi, le alghe microscopiche e anche identità non cellulari, come virus e prioni. La microbiologia medica è invece la branca della microbiologia che studia i rapporti tra i microbi e l’uomo.

Fasi di infezione

• Contagio: contatto tra il microrganismo e il suo ospite.
• Infezione: penetrazione e moltiplicazione di microrganismi ospite.
• Colonizzazione: persistenza e moltiplicazione del microrganismo nell'ospite.
• Malattia: si verifica quando l'interazione tra il microrganismo e l'individuo porta a un processo patologico, caratterizzato da un danno per l'ospite.
• Sopravvivenza: il microrganismo non si riproduce, o si riproduce il minimo per mantenersi in vita (latenza, forme di resistenza, spore).

Non sempre all'infezione segue la patologia ma è il presupposto per l'instaurarsi della malattia.

Microrganismi

• Patogeni opportunisti: microrganismi normalmente non patogeni, che possono causare malattie quando si riducono i normali meccanismi di difesa dell'ospite. Sempre più comuni a causa dell'aumento dell'immunosoppressione da farmaci, da terapia radiante e da malattie immunosoppressive.
• Patogeni primari o altamente virulenti: microrganismi che causano malattia ogniqualvolta colonizzano l'ospite (Salmonella, Gonococco, Mycobacterium tuberculosis, virus della rabbia...).

Relazioni tra microrganismo e ospite

Tra microrganismo ed ospite possono stabilirsi varie forme di relazione:

• Parassitismo: una delle due specie conviventi ricava vantaggio, l'altra danno.
• Mutualismo: il vantaggio riguarda entrambe (Microbiota o flora microbica naturale, es. microbiota intestinale).
• Commensalismo: il vantaggio riguarda una sola delle due specie ma l'altra non è danneggiata (flora saprofita).

Tutte queste forme di relazione possono essere obbligatorie o facoltative. Commensalismo e mutualismo rappresentano forme evolutive di un originale parassitismo.

Interazione parassite-ospite

È una relazione dinamica tra i due organismi, che risente dei cambiamenti del patogeno, dell'ospite e dell'ambiente. La colonizzazione di un ospite e il livello dell'eventuale danno da parte di un microrganismo dipende da:

• Fattori specifici del microrganismo
• Fattori specifici dell'ospite
• Fattori ambientali

Principali molecole riconosciute dall'immunità innata (PAMPS)

• Lipopolisaccaride (LPS) parete batterica Gram negativi
• Peptidoglicano, presente in particolare nei Gram positivi, ma anche nei Gram negativi
• Acido lipotecoico parete batterica Gram positivi
• Mannosio: costituente di carboidrati in batteri e virus, poco presente nell'ospite umano
• Flagellina (flagelli batterici)
• Pilina (pili batterici)
• Acido nucleico batterico ricco di sequenze dinucleotidiche citosina-guanina non metilate (CPG)
• RNA a doppia elica (unico dei virus)
• β-glucano (miceti)
• Acido lipotecoico, glicolipidi e zymosan (parete dei lieviti)

Batteri

Sono cellule procarioti che, le principali forme sono sferica (cocchi), bastoncellare (bacilli), elicoidale (spirilli e vibrioni). La cellula batterica ha dei componenti fondamentali che sono necessari alla vita della cellula stessa: la membrana cellulare, il citoplasma, i nucleotidi, i ribosomi e corpi inclusione. Componenti accessori che conferiscono caratteri aggiuntivi (i flagelli e le fimbrie) e la capsula.

L’informazione genetica dei batteri è contenuta nel nucleoide e nei plasmidi. Il nucleoide della singola molecola di DNA senza involucro cellulare contiene i geni essenziali per la vita del batterio. La parete batterica del batterio ha una struttura rigida che conferisce la forma alla cellula batterica, la protegge da stress fisici, chimici e meccanici ed esplica le sue funzioni antigieniche.

Capsula

Formata da mucopolisaccaridi secreti dalla cellula batterica e ha funzione antifagocitaria. Alcuni batteri possiedono la capsula in vivo ma non la producono in vitro. Si evidenzia con inchiostro di china.

Esempi di alcuni batteri che sintetizzano la capsula

• Streptococcus pneumoniae: agente di polmonite, meningite, otite
• Haemophilus influenzae di tipo b: agente di meningite, otite, sinusite
• Neisseria meningitidis: agente di meningite, meningoencefalite, polmonite
• Bordetella pertussis: agente della pertosse catarrale e parossistica
• Bacillus anthracis: agente dell'antrace cutaneo, polmonare, gastrointestinale

La parete cellulare

Esternamente alla membrana c'è la parete cellulare sulla cui superficie si trova spesso uno strato polisaccaridico che costituisce la capsula. La parete è presente anche nelle cellule vegetali e nei miceti, ma quella dei batteri è più complessa e distingue i batteri in Gram+ e Gram-.

È costituita da peptidoglicano, un polimero di due zuccheri che si alternano: N-acetilglucosamina ed acido muramico. Ogni molecola di acido muramico lega un tetrapeptide costituito nell'ordine da: L-alanina, Acido D-glutamico, Acido meso-diaminopimelico o L-lisina e D-alanina. La struttura polimerica del peptidoglicano è responsabile della rigidità della parete.

Colorazioni

• Semplici (cristalvioletto, fuxina basica, blu di metilene)
• Differenziali (Gram, Ziehl-Neelsen)

Per colorare la cellula batterica si usano solamente coloranti basici in quanto è uniformemente basofila. Tutti i campioni devono essere fissati (calore, fissativi chimici) prima di essere colorati. Gram+ risultano colorati in violetto, Gram- risultano colorati in rosso.

Prima si mette il viola, poi si lava con l’alcol e si mette rosso. Il Gram+ mantiene il primo colore perché non ha la membrana esterna, mentre il Gram- mantiene solo il rosso a causa della sua membrana esterna.

Parete dei batteri Gram

Ha uno spessore da 10 a 25 volte più sottile di quella dei Gram+ e non ha intercalati gli acidi teicoici. Presente una seconda membrana esterna alla parete denominata lipopolisaccaride batterico (LPS) estremamente tossico per l'uomo e per gli animali, causa dello shock tossico in caso di batteriemia da batteri Gram-. LPS viene detto anche ENDOTOSSINA.

Il lipopolisaccaride batterico (LPS) è formato da:

• Una porzione lipidica denominata lipide A
• Una corta catena di zuccheri che forma il "core"
• Una lunga catena polisaccaridica con attività antigenica (antigene O)

Spazio periplasmatico = spazio compreso tra parete e membrana esterna.

Lipopolisaccaride

È formato da:

• Antigene O: polisaccaride lineare formato da 50-100 unità saccaridiche. Permette di distinguere tra sierotipi (ceppi) di una stessa specie batterica. Fornisce una notevole compattezza al batterio.
• Lipide A: formato da un disaccande di glucosammina fosforilata e acidi grassi, è responsabile dell'attività endotossica dell'LPS.
• Core: polisaccaride ramificato essenziale per la struttura del batterio.

Alcune specie hanno anche i flagelli (locomozione) e i pili (adesione e coniugazione).

Flagelli

Sono formati da un unico filamento, sprovvisto di membrana ma costituito da subunità proteiche di una particolare proteina chiamata flagellina con attività anti igienica, denominata antigene H.

Pili

Possiedono lunghezza compresa tra 0,2-2 micrometri, e sono specifici organi di ancoraggio. Sono responsabili dell'iniziale processo infettivo e della proprietà emoagglutinante dei batteri. Sono formati dalla ripetizione di subunità di una o due proteine (piline) con funzione di adesione (adesione) a particolari substrati.

Una classe particolare di pili, di dimensioni maggiori rispetto a quelli con funzioni di adesione, è rappresentato dai pili F coinvolti nel processo di cognizione batterica. Come fattore di adesività le punte delle fimbrie contengono delle proteine (lectine) che legano specifici zuccheri (e.g, mannosio).

Cromosoma batterico

Il cromosoma batterico è direttamente immerso nel citoplasma. Il citoplasma è delimitato esternamente da una membrana citoplasmatica dalla quale si dipartono verso l'interno delle invaginazioni che formano il sistema dei mesosomi coinvolti in diverse funzioni tenere legato il cromosoma batterico facilitando la separazione dei due filamenti di DNA e la produzione del setto trasverso.

Plasmidi

Sia i batteri Gram+ che quelli Gram- possiedono in aggiunta al cromosoma batterico un elevato numero di elementi genetici accessori detti plasmidi. I plasmidi sono elementi genetici extracromosomici formati da DNA bicatenario a struttura circolare costituito da un numero di coppie di basi variabile da 1000 a 200.000.

I plasmidi codificano per tutti i materiali necessari e sufficienti per la duplicazione e ripartizione nelle due cellule figlie ma possono anche codificare per materiali richiesti dal batterio per sopravvivere. In particolari "nicchie ecologiche" quali, tossine, pili, adesine ed enzimi in grado di conferire resistenza all'azione di farmaci antibatterici detti plasmidi o fattori R.

Plasmidi coniugativi

Alcuni plasmidi detti plasmidi coniugativi codificano per una serie di prodotti che vengono richiesti per trasferire un plasmide da una cellula ad un'altra attraverso un "ponte coniugativo" permettendo un trasferimento orizzontale del plasmide (da una cellula "donatrice" ad una cellula "accettrice").

Coniugazione batterica

È il trasferimento di materiale genetico da un batterio, che possiede il plasmide F (F+), ad un altro che non lo possiede (F-). La coniugazione batterica avviene tra batteri F+, in cui il plasmide F codifica anche per la produzione del pilo F, che serve ad ancorare le cellula, e batteri F-.

Batteri

• Aerobi obbligati = si sviluppano solo in presenza di ossigeno
• Aerobi facoltativi = si sviluppano con e senza ossigeno
• Anaerobi obbligati = si sviluppano solo in assenza di ossigeno
• Microaerofili = si sviluppano bene a bassa tensione di ossigeno

Spora

Esclusiva dei batteri Gram+ del generi Bacillus e Clostridium. Le spore batteriche sono endospore, si formano per resistere a condizioni ambientali avverse e si liberano per rottura della cellula madre, che prende il nome di sporangio. Nei batteri del genere Bacillus il diametro della spora non eccede quello della cellula batterica. Nei batteri del genere Clostridium invece il diametro della spora è maggiore di quello della cellula batterica.

La spora è resistente al calore, all'essiccamento, ai disinfettanti e alle radiazioni e può rimanere quiescente anche per centinaia di anni. In condizioni ambientali favorevoli (acqua, calore, sostanze nutritive), la spora germina liberando la cellula batterica.

Potere patogeno dei batteri

Un batterio è patogeno quando:

• Invade i tessuti
• Vi si moltiplica
• Danneggia il normale funzionamento dell'organismo ospite
• Produce sostanze tossiche

Rapporto ospite microrganismo

La patogenicità è caratterizzata da:

• Fattori e meccanismi di virulenza
• Carica batterica (numero iniziale di batteri infettanti)
• Stato di salute, in particolare immunitario, dell'ospite

Adesione

Le caratteristiche di adesione di un batterio possono determinare il grado di patogenicità. I batteri che sono dotati di adesine si legano a specifici recettori di natura glicoproteica o glicolipidica presenti sulla superficie dei tessuti e non vengono allontanati per esempio dal lavaggio dell'urina o dalla peristalsi intestinale. Le adesine sono molecole proteiche presenti all'apice di fimbrie o pili che si legano a particolari zuccheri presenti sulla superficie dei tessuti bersaglio.

Invasione

Fase che segue l'adesione e determina l'invasione dei tessuti, spesso associata alla proliferazione del batterio. È mediata dalla presenza di fattori che favoriscono la penetrazione nel tessuto. In batteri che penetrano nella cellule, l'invasione è il passaggio successivo all'adesione e consiste nell'internalizzazione del batterio nelle cellule epiteliali dove i batteri possono essere liberi nel citoplasma o contenuti all'interno di un vacuolo in cui sopravvivono e si moltiplicano.

Fattori di virulenza batterica

• Fattori antifagocitari
• Competitori per il ferro (siderofori)
• Metaboliti
• Enzimi degradativi
• Tossine
• Formazione biofilm

Fattori antifagocitari

La capsula è il più importante fattore antifagocitario. I ceppi batterici dotati di capsula sono più virulenti e più resistenti alla fagocitosi e alla lisi intracellulare dei ceppi non capsulati.

Leucocidina = prodotta da alcuni ceppi di Staphylococcus aureus svolge attività antifagocitaria in quanto capace di uccidere leucociti e macrofagi, formando su queste cellule dei pori, che ne aumentano la permeabilità ai cationi.

Enzima coagulasi - prodotta sempre da Staphylococcus aureus, contribuisce all'attività antifagocitaria, formando uno strato di fibrina attorno alla cellula batterica che non può venire fagocitata.

Competitori per il ferro (siderofori)

Il ferro presente nel corpo umano è solo parzialmente disponibile per il metabolismo batterico in quanto la maggior parte è legato all'emoglobina negli eritrociti, alla transferrina nel plasma, alla lattoferrina nelle lacrime, nella saliva e nel muco bronchiale, nella bile e nel muco intestinale. I batteri producono siderofori e proteine recettoriali sulla loro superficie, capaci di riconoscere i siderofori stessi. In questo modo i batteri possono sottrarre all'ospite ferro da utilizzare per il loro metabolismo.

Metaboliti

Molti dei prodotti metabolici derivanti dalla crescita batterica rappresentano fattori di virulenza, capaci di causare malattia. Acidi, gas ed altri prodotti del metabolismo batterico possono risultare tossici per il tessuto.

Enzimi degradativi

Sono capaci di dissolvere i tessuti e distruggere le barriere fisiche che potrebbero limitarne la diffusione.

• Collagenasi: degrada il collagene
• Fosfolipasi: depolimerizza le membrane cellulari
• Proteasi: degrada le IgA presenti sulle mucose
• Ialuronidasi: liquefà l'acido ialuronico del connettivo
• Fibrinolisina: elimina i coaguli di fibrina che si formano nel processo infettivo per limitare la diffusione batterica
• Lipasi: degrada lo strato lipidico dell'epidermide
• Emolisina: lisa le emazie

Tossine

Si dividono in:

Endotossine

• Termostabili
• Scarso potere antigene (legato alla porzione polisaccaridica)
• Potere tossico (legato alla porzione lipidica) non neutralizzato dall'anticorpo corrispondente
• Resistenti all'azione dei succhi gastrici

Sono componenti tossiche esclusive della parete dei batteri Gram-. Chimicamente sono lipopolisaccaridi (LPS) costituiti da una porzione lipidica ed una polisaccaridica. L'endotossina lega specifici recettori presenti su macrofagi, cellule B ed altre cellule e stimola la produzione ed il rilascio di Citochine di fase acuta quali IL-12, IL-6, prostaglandine e Tumor Necrosis Factor (TNF-a).

Effetti biologici delle endotossine

A basse concentrazioni stimola l'insorgere di risposte protettive:

• Febbre
• Vasodilatazione
• Risposta immunitaria
• Risposta infiammatoria

Ad alte concentrazioni determina l'insorgenza di fenomeni quali:

• Febbre alta
• Petecchie (dovute alla dilatazione dei capillari)
• Ipotensione
• Shock (per vasodilatazione ed aumentata permeabilità capillare)
• Coagulazione del sangue
• Morte

Esotossine

Sono prodotti batterici tossici che vengono rilasciati all'esterno dal batterio (proteine) sia dai Gram+ che dai Gram-.

• Proteine
• Termolabili (a 60°C vengono inattivate)
• Elevato potere antigene
• Potere tossico neutralizzato dall'anticorpo corrispondente
• Distrutte dall'azione dei succhi gastrici

Sono proteine prodotte da batteri Gram-positivi o Gram-negativi che si legano ad un recettore presente sulla cellula. Molte esotossine sono dimeriche (Tossine A-B) cioè formate da 2 subunità (A e B): la porzione B si lega ad uno specifico recettore cellulare mentre la subunità A è trasferita all'interno della cellula, dove viene indotto il danno cellulare.

Effetti biologici delle esotossine

Gli effetti biologici principali sono:

• Dermonecrotico
• Edemigeno
• Emolitico

Classificazione delle esotossine in base al livello di azione

• Agiscono a livello extracellulare
• Agiscono a livello della membrana cellulare
• Penetrano nelle cellule modificandone la regolazione
• Penetrano nelle cellule uccidendole

Classificazione delle esotossine in base al bersaglio di azione

A seconda della presenza di specifici recettori cellulari le tossine si distinguono in:

• Tossine citolitiche o emolisine
• Leucocidine
• Tossine neurotrope
• Enterotossine
• Tossine pantrope

Tossine citolitiche o emolisine

Danneggiano la membrana cellulare provocando:

• Formazione di pori o canali che alterano la funzionalità della cellula
• Distruzione enzimatica della porzione lipidica della membrana cellulare

Streptococchi

In terreno agar-sangue possono formare:

• Un alone di emolisi completa (B-emolisi)