Reattori Biochimici per Applicazioni Analitiche e Terapeutiche (RBAAT) - Prof. D. Pirozzi

Reattori biochimici per applicazioni analitiche e terapeutiche

Prof. Domenico Pirozzi

A.A. 2017/2018

A cura di: Federica Amitrano

Sommario

• Spettrofotometria ....................................................................................................................................... 3
• Enzimi nell'analisi di sostanze di interesse clinico ......................................................................................................... 11
• Analisi del Colesterolo ............................................................................................................................................. 13
• Analisi del Glucosio .................................................................................................................................................. 15
• Analisi del Fruttosio ................................................................................................................................................. 17
• Analisi dell’Acido Urico ............................................................................................................................................ 18
• Analisi dell’Ammoniaca ........................................................................................................................................... 19
• Analisi dell’Urea ...................................................................................................................................................... 20
• Analisi dell’Etanolo .................................................................................................................................................. 21
• Proteine ......................................................................................................................................................... 23
• Tipi di proteine ............................................................................................................................................................... 25
• Struttura delle proteine ............................................................................................................................................... 27
• Enzimi ........................................................................................................................................................................... 34
• Meccanismo Catalitico degli Enzimi ........................................................................................................................ 34
• Cinetica Enzimatica ................................................................................................................................................. 36
• Velocità di Reazione ............................................................................................................................................................... 38
• Determinazione dell’Attività di specifici Enzimi a scopo Diagnostico .................................................................................... 40
• Diagnosi della Patologia ................................................................................................................................................... 42
• Disturbi del Fegato – Fosfatasi Alcalina ............................................................................................................................ 43
• Disturbi del Fegato – Transaminasi .................................................................................................................................. 46
• Disturbi del Fegato – Glutamiltrasferasi ..................................................................................................................... 49
• Infarto al Miocardio .......................................................................................................................................................... 49
• Differenziazione tra Infarto al Miocardio e Disturbi al Fegato ......................................................................................... 50
• Purificazione delle proteine ...................................................................................................................... 53
• Rottura delle pareti cellulari ....................................................................................................................................... 54
• Trattamenti Meccanici ............................................................................................................................................ 54
• Trattamenti Enzimatici ............................................................................................................................................ 54
• Separazione delle proteine dai componenti non proteici ............................................................................................................... 55
• Separazione di una proteina da altre proteine ............................................................................................................... 56
• Metodi di Frazionamento a Bassa Risoluzione ........................................................................................................ 57
• Tecniche Cromatografiche ...................................................................................................................................... 60
• Cromatografia Gel – Filtration ............................................................................................................................................... 61
• Esempio ............................................................................................................................................................................ 63
• Cromatografia a Scambio Ionico ............................................................................................................................................ 64
• Cromatografia per Affinità ..................................................................................................................................................... 65
• Selezione dei campioni raccolti dopo ciascuno stadio di purificazione ........................................................................... 67
• Misura della Concentrazione Totale di Proteine ..................................................................................................... 67
• Valutazione dell’Efficacia della Purificazione .......................................................................................................... 68
• Esempio ................................................................................................................................................................... 69
• Esempio: sequenza di stadi di purificazione .......................................................................................................................... 74
• Elettroforesi ................................................................................................................................................................ 76
• Apparato urinario ....................................................................................................................................... 81
• Rene .............................................................................................................................................................................. 83
• Nefroni ..................................................................................................................................................................... 84
• Ultrafiltrazione ....................................................................................................................................................................... 86
• Riassorbimento ...................................................................................................................................................................... 89
• Secrezione .............................................................................................................................................................................. 93
• Patologie dell’apparato urinario ................................................................................................................................. 94
• Dialisi ....................................................................................................................................................................... 95
• Scambio dei Soluti ................................................................................................................................................................. 98
• Emodialisi ............................................................................................................................................................................. 100
• Emofiltrazione ...................................................................................................................................................................... 101
• Efficienza della Separazione ........................................................................................................................................... 103
• Dialisi Peritoneale ................................................................................................................................................................ 103
• Trasporto attraverso le pareti di un condotto ........................................................................................................... 105
• Elettrodi ...................................................................................................................................................... 115
• Cella Galvanica Rame – Zinco ...................................................................................................................................... 116
• Elettrodi Metallici ...................................................................................................................................................... 118
• Sensori Potenziometrici ............................................................................................................................................... 119
• Sensore Potenziometrico a Vetro per la Misura del pH ......................................................................................... 120
• Sensori Amperometrici .......................................................................................................................................... 124
• Sensore per la Misura di Acqua Ossigenata .......................................................................................................... 129
• Carbonato anidrasi .................................................................................................................................. 133
• Schema della Circolazione Sanguigna .......................................................................................................................... 134
• Dispositivi di Assistenza Espiratoria ............................................................................................................................ 136
• Rimozione della dall’Atmosfera .................................................................................................................... 137
• Test sperimentali ......................................................................................................................................................... 139

1. Spettrofotometria

La spettrofotometria è una tecnica analitica basata sull’assorbimento di radiazioni luminose da parte di soluzioni o di gas. Al variare della lunghezza d’onda abbiamo diverse tipologie di radiazioni ed in particolare la spettrofotometria si occupa delle variazioni nella regione spettrale compresa tra 200 900, quindi le lunghezze d’onda che corrispondono alla regione del visibile ed in parte a quella dell’ultravioletto.

La lunghezza d’onda della luce visibile va indicativamente dai 200 ai 700 ed al variare della lunghezza d’onda abbiamo diversi colori.

Uno strumento fondamentale in ambito spettrofotometrico è lo spettrometro. Tale strumento consente di determinare la capacità di un mezzo, in genere di un liquido, di assorbire luce.

Lo spettrofotometro presenta:

• Un monitor: dove è possibile leggere un valore;
• Una tastiera: utilizzata per inserire il valore di lunghezza d’onda. È importante sottolineare che ogni soluto ci darà un valore di assorbanza ad una determinata lunghezza d’onda. Se cambio la lunghezza d’onda, non avrò più lo stesso valore di assorbanza, perché il raggio di luce inciderà sulla soluzione in maniera differente. Questa tastiera quindi ci fornisce la possibilità di inserire la lunghezza d’onda a cui noi intendiamo leggere l’assorbanza di quella data sostanza.

Sul monitor ci sono due valori: un valore che è quello della lunghezza d’onda stabilito per una determinata prova (600); un altro valore più in basso che è il valore dell’assorbanza letto dallo strumento (data) che può essere negativo e non perché esista un valore di assorbanza negativo (ricordiamo la definizione di assorbanza) ma perché nello strumento non c’è nessun campione ancora.

Immaginiamo di avere una provetta con del liquido verde e di farla attraversare da una radiazione luminosa:

Vogliamo sapere quanto vale la radiazione luminosa che riesce ad attraversare la provetta e quanta parte invece viene assorbita da essa. Queste misure si fanno ad una specifica lunghezza d’onda quindi sul display dello strumento si indica a quale delle lunghezze d’onda intendiamo effettuare la misura.

Questa operazione la si fa utilizzando un generatore di radiazione, ad esempio una lampadina, che solitamente genera una radiazione piuttosto complessa che è la sovrapposizione di diverse radiazioni a varie lunghezze d’onda, tra queste va isolata quella di nostro interesse.

La radiazione viene fatta passare attraverso un prisma che, per effetto dei fenomeni di diffrazione, determina una deviazione differenziata, con diversi angoli, delle varie componenti della radiazione a seconda della lunghezza d’onda. Dopo l’attraversamento del prisma si possono distinguere le varie componenti nelle diverse direzioni, avremo il rosso, giallo, blu ecc.

Questa deviazione differenziata delle radiazioni componenti la radiazione emessa dalla lampadina ci consente di selezionare quella che a noi serve. Faremo in modo che solo la radiazione alla lunghezza d’onda da noi prescelta attraversi il campione.

Solitamente queste misure si fanno ad una lunghezza d’onda ben determinata perché le soluzioni di liquido solitamente assorbono più a delle lunghezze d’onda e meno ad altre lunghezze d’onda, quindi per scopi analitici che ci prefiggiamo è più utile adottare quelle lunghezze d’onda in corrispondenza delle quali questa assorbanza è maggiore.

Chiamiamo l’intensità della radiazione che arriva sul liquido 0 e ci sarà una radiazione residua che è riuscita ad attraversare il liquido di intensità. Ovviamente < 0 e nella migliore delle ipotesi, ovvero nel caso in cui il liquido non sia in grado di assorbire alcuna frazione di questa radiazione, = 0. Quanto più il liquido è in grado di assorbire, tanto più piccola sarà l’intensità della radiazione residua. Nel caso in cui il liquido è in grado di assorbire tutta la radiazione, allora = 0.

Lo spettrofotometro è in grado di misurare sia la radiazione incidente sia la radiazione finale ed è in grado di confrontarle. È chiaro che ogni liquido, a seconda delle sostante disciolte in esso, ha capacità di assorbimento differente. Sappiamo che l’acqua da sola è trasparente ma un solubile disciolto in essa non sempre ha la capacità di assorbire.

Ad esempio, sciogliamo una zolletta di zucchero in acqua, l’acqua rimane trasparente il che vuol dire che gli zuccheri non sono sostanze cromofore, ovvero non sono in grado di assorbire luce. Se invece versiamo una goccia di sciroppo di amarena l’acqua comincia ad acquisire quel colore roseo.

Ciò non significa che quella soluzione assorbe particolarmente la componente rosa della radiazione ma al contrario assorbe tutte le componenti di quella radiazione tranne il rosa che passerà attraverso la sostanza.

Ad esempio, in questa immagine:

È possibile notare che il liquido verde lascia passare la radiazione verde. Mentre invece in questa immagine:

Il liquido verde non lascia passare la radiazione blu. Nel primo caso quindi il liquido ha una ridotta assorbanza e quindi sarà simile ad < 0, nel secondo caso invece assorbe notevolmente la radiazione per cui 0.

Tornando all’esempio dello sciroppo d’amarena, se aggiungiamo altre gocce il liquido assume un colore rosso sempre più intenso fino a diventare rosso scuro. Questo ci suggerisce che al crescere della concentrazione di questa sostanza, la soluzione assorbe una quantità di luce sempre maggiore evidenziando sempre di più la prevalenza di colore rosso.

Misurando l’assorbanza di una soluzione, cioè la capacità di assorbire luce di una soluzione, siamo in grado di risalire alla concentrazione della sostanza in questo liquido. Quando in una soluzione c’è una sola sostanza cromofora, quindi in grado di assorbire la luce, è possibile trovare una relazione tra l’assorbanza, capacità di assorbire la luce, e la concentrazione della sostanza.

Nota questa relazione, effettuando le misure che ci forniscono informazioni sulla frazione di radiazione assorbita, da questa frazione si può risalire alla concentrazione di questa sostanza visto che al crescere della concentrazione della sostanza la soluzione è in grado di assorbire una frazione sempre maggiore della radiazione luminosa.

Diamo una definizione più rigorosa. Abbiamo visto che ed sono le intensità della radiazione 0 rispettivamente prima e dopo l’attraversamento della soluzione liquida. Immaginiamo di avere un campione di l