Metodologie e tecniche analitiche in biochimica clinica

Metodologie e tecniche analitiche in biochimica clinica

Il laboratorio

In laboratorio si distinguono tre fasi del flusso di lavoro (in cui i dati vengono influenzati da varie cose):

Preanalitica

• Strumentale di preparazione dello strumento come la carica dei reattivi
• Campione biologico deve essere prima trattato o no
• Paziente (se prima di fare il prelievo ha mangiato e si cerca la glicemia questa verrà sballata)
• Operatore (sia chi fa il prelievo, lo smistamento e chi prende in carico il campione)

La preanalitica si divide in interna (strumentale, conservazione e trattamento del campione biologico) ed esterna (dipendente dal percorso del campione biologico).

Analitica

Ha a che fare con l’operatore e strumentale.

Post analitica

Comprende aspetti strumentali (per esempio la fase della manutenzione che però può rientrare anche nella preanalitica dipende dall'organizzazione del laboratorio), del campione biologico (stoccato, ritrattato) e della cartella clinica (referto, trasmissione dei dati).

Il tecnico interviene in tutte e tre queste fasi in cui vengono coinvolte tante figure (infermieri, OSS, tecnici, medici, amministrativi) e il tecnico e il medico sono quelli che hanno la possibilità di fornire una valutazione di merito (ovvero la produzione di un dato analitico, del risultato) quindi in automatico il tecnico diventa responsabile del dato analitico. Nella fase preanalitica interviene molto il tecnico ma anche le altre figure sono importanti (se l'infermiere mette il sangue nella provetta sbagliata il risultato sarà alterato) e nella post analitica si interviene dal punto di vista del referto quando per esempio c'è un dato che non torna con la storia clinica.

Preanalitica

In preanalitica è possibile che ci siano degli errori o non conformità (prima ancora dell'arrivo della provetta in laboratorio = preanalitica esterna):

• Errata identificazione del paziente/utente (per esempio senza nome)
• Scambio di persona e/o provette (ce ne accorgiamo quando esce il dato)
• Preparazione non corretta del paziente/utente
• Mancata trascrizione del paziente/utente sulle provette
• Applicazione prolungata del laccio emostatico (emolisi)
• Contaminazione da liquidi di infusione venosa
• Riempimento incompleto delle provette contenenti anticoagulante
• Uso di provette con anticoagulante non idoneo (la provetta in K3 EDTA viene centrifugata e si eseguono analisi sul surnatante e molti esami li posso fare ma se misuro il potassio lo troverò altissimo)
• Emolisi, lipemia, ittero (parametri che possono influenzare il dato)
• Mancata consegna della richiesta/difformità tra codice a barra della scheda e delle etichette (controllare a prelievo avvenuto il numero di etichette utilizzato ed il numero di provette etichettate) ma oggi con le strumentazioni automatizzate questo problema non c'è più (ogni provetta ha un codice univoco specifico per l'esame che deve fare)

Ci sono anche altri errori in preanalitica che possono interferire, spesso si possono avere dei problemi riguardanti l'uso di plasma o siero e in generale si usano l'uno o l'altro perché per esempio il siero è più liquido del plasma che è più denso e quindi si preferisce usare il siero in chimica clinica (altrimenti l’anticoagulante usato è la litio eparina) mentre un vantaggio del plasma rispetto al siero è che mantiene un’emolisi inferiore (e i valori su plasma di potassio sono del 10% inferiori rispetto al siero).

Il plasma è la parte liquida del sangue, ha un caratteristico colore giallo paglierino ed è composto per il 90% da acqua, in cui sono disciolti sali e proteine plasmatiche (albumina, fibrinogeno e fattori della coagulazione prodotti dal fegato, le immunoglobuline). Il siero sanguigno è semplicemente plasma privo di fibrinogeno, fattore VIII, fattore V e protrombina, si ottiene lasciando coagulare il sangue e successivamente centrifugandolo (o semplicemente lasciando depositare sul fondo del recipiente la parte coagulata, più pesante).

La differenza fra siero e plasma è molto importante infatti il siero è un liquido incoagulabile, mentre il plasma lasciato a se stesso in un recipiente coagula spontaneamente a causa del fibrinogeno e delle altre proteine della coagulazione che contiene, quindi la differenza consiste soprattutto nel diverso contenuto in proteine correlate ai meccanismi della coagulazione e dell’emostasi.

In laboratorio molti esami ematochimici si eseguono indifferentemente su siero o su plasma, alcuni soltanto richiedono necessariamente l’uno o l’altro componente del sangue e tra questi si citano ovviamente per la misura quantitativa dei fattori della coagulazione, che si eseguono necessariamente sul plasma (quando possibile si preferisce operare sul siero che è più facile da trattare).

Per quanto riguarda la differenza tra emolisi, lipemia e ittero, fino a pochi anni fa si facevano delle scale di colori (si facevano delle provette tutte con lo stesso lume e con il contenuto alla stessa altezza valutando quanta emoglobina libera c'è nella provetta nel caso dell'emolisi) e si interpretavano così e c'era il problema della soggettività mentre oggi lo strumento è in grado di valutarlo in automatico; oltre al colore si può osservare anche la densità (difficile da valutare a occhio anche in questo caso) e le strumentazioni riescono a valutare anche quella.

Esempi di interferenze

• Farmaci possono modificare i risultati dell'esame delle urine, per esempio i diuretici possono interferire indirettamente diluendole, causando difficoltà nell'identificazione di reperti patologici ed una distruzione accelerata di elementi figurati (con alterazioni anche nello striscina per la liberazione di alcune sostanze in questi elementi figurati)
• L'eliminazione delle emazie nelle urine può aumentare dopo lo sforzo e la stessa cosa può avvenire per la proteinuria (per questo motivo nei controlli di routine si sconsiglia di eseguire l'esame in queste circostanze e specialmente dopo attività fisica intensa)
• Prolungata conservazione del campione a temperatura ambiente è invece una frequente causa di falsi positivi su ricerca batteriologica

Alcune problematiche legate a preanalitica:

• Campione ematico per alcolemia lasciato aperto (l’alcol evapora)
• Campione ematico per emocromo con microcoaguli (se ci sono 10 globuli rossi ne conta 1 e viene un risultato anomalo)
• Campione ematico per ammonio tenuto a temperatura ambiente (aumenta il valore perché è un prodotto di scarto)
• Campione ematico per glicemia tenuto per più tempo sul banco di lavoro (il globulo rosso utilizza il glucosio di cui verrà restituito un valore basso)
• Campione per biologia molecolare conservato in una provetta non RNA free
• Ricerca di cilindri urinari in un'urina conservata per troppo tempo sul banco di lavoro (non si può fare perché si rompono, sono presenti quando si ha un problema renale come una nefropatia e in questa situazione è fondamentale che le urine siano fresche)

La strumentazione ad oggi ci aiuta su alcuni di questi parametri (come ittero, lipemia, rilevatore di coagulo, leggono il volume di campione) e inoltre è importante fare attenzione alle manutenzioni strumentali, ai magazzini e all'ambiente di lavoro.

Il mondo TSLB

Le comunicazioni informatiche all'interno di un ospedale sono complesse e richiedono diverse tipologie di sistemi informatici in base al tipo di reparto e laboratorio, sono sistemi abbastanza complicati dietro ai quali c'è anche tutta una parte amministrativa (per il pagamento dell'esame); uno strumento quando incontra una provetta legge il bar code e lo associa a paziente e all'esame da fare (interviene la parte informatica per controllare che effettivamente ci sia quel paziente anche nel caso in cui il bar code venga letto male) e quando il referto è completato e il medico lo ha firmato finisce nella cartella clinica. Openlis è il sistema gestionale dell’85% di aziende e laboratori, Winsap dell'anatomia patologica e Pleiade e First Aid ci sono nei reparti. Il sistema dei trasporti dei campioni avviene con macchine apposite e posta pneumatica a orari determinati.

Molte aziende ospedaliere hanno iniziato ad agganciarsi sempre di più ai sistemi automatizzati (in grado di smistare, centrifugare e aliquotare campioni biologici) e ogni strumento automatizzato utilizza i sistemi informatici o come interprete o controllore, possono lavorare per un unico laboratorio oppure per più laboratori (come nel caso della preanalitica dipartimentale) quindi dal momento in cui c'è una provetta lo strumento deve sapere di chi è, per quale laboratorio, che analita è ricercato e deve controllare se la provetta rientra nei parametri richiesti; i macchinari possono solo indirizzare i flussi (come la catena della coagulazione) oppure anche partecipare alla preparazione del campione (centrifugare e aliquotare).

Lo smistamento prevede che una volta riconosciuto il campione i sistemi abbiano indicazioni sui percorsi successivi, poi se un campione deve essere centrifugato ci devono essere informazioni sul tempo e numero di giri e la stessa cosa per l'aliquotazione (quanto volume e quante aliquote) quindi la macchina ha bisogno di tantissime informazioni (in modo per esempio anche da dividere i campioni urgenti da quelli di routine); le strumentazioni hanno un proprio software che gli permette di far lavorare lo strumento e di gestire i rapporti con i sistemi informatici gestionali.

Nello strumento passa una provetta, legge il codice e interroga il sistema gestionale (OpenLis) sulla parte sanitaria (nome cognome del paziente e cosa deve fare di esami), questi dati vengono inviati al CITM (sistema informatico dello strumento) dalla software house (gestionale) che trasforma questi dati in codici riconosciuti dalla macchina e con tutte queste informazioni tradotte il macchinario inizia a dire ai suoi moduli cosa fare con la provetta; molti strumenti a orari ben definiti scaricano tutti i codici in accettazione (Host query) e quando incontreranno il codice interrogano la sua memoria mentre altri strumenti interrogano direttamente OpenLis. Invece gli strumenti singoli (Stand alone) quando incontrano il codice interrogano OpenLis e scaricano ciò che è legato a quel codice.

Movimento delle provette in preanalitica dipartimentale

• Le provette vengono inserite nella tramoggia che è una sorta di cassetto in cui vengono rovesciate, c'è una piccola catena che le tira su e le va a disporre su un unico binario che le trasporta ai passaggi successivi (tramite i rack di trasporto) e inoltre c'è anche un primo sensore che legge la direzione della provetta (se deve la gira) che entra dentro lo strumento in cui c'è un piccolo modulo che fotografa il codice della provetta, la sua dimensione (quanto è alta e larga), il colore del tappo sapendo in questo modo dove deve andare, cosa deve fare e se è giusta ma sa anche se gli basta la quantità di materiale per fare le aliquote (perché legge anche il livello) quindi si potrebbero avere provette che escono come errori perché i tappi non vanno bene, il codice può non essere letto oppure non sono riuscito a leggere il volume e se devo aliquotare non lo fa.
• Modulo centrifuga se la provetta deve essere centrifugata e questo ce lo dice il codice a barre che può variare in base al tipo di esame che deve essere fatto (in azienda è stato deciso di fare una centrifugata unica che più o meno va bene per tutti).
• Catena in cui ho un flusso singolo di provette e ognuna di queste ha un proprio percorso.
• Aliquotatore provette che necessitano di essere aliquotate dopo la centrifuga passano in un modulo aliquotatore che ha un pipettatore automatico, puntali e capacità di stampare delle etichette ottenendo da una provetta madre una o più figlie (provette ritappate da un fusore con carta argentata) e poi vengono a loro volta indirizzate verso il proprio percorso.

Alla fine le provette arrivano in dei rack (smistate nella modalità informaticamente preimpostata all'inizio del lavoro) in cui si ha lo smistamento finale nel modulo di uscita. Poi a seconda del tipo di laboratorio i moduli vengono utilizzati in modo diverso per esempio coagulazione e ematologia hanno delle catene che svolgono solo lo smistamento, la preanalitica dipartimentale ha una strumentazione completa (smistamento, centrifugazione e aliquotazione) e quella del corelab ha solo smistamento e coagulazione mentre in endocrinologia c'è una catena che fa solo smistamento e aliquotazione (perché dalla preanalitica dipartimentale arrivano le provette già centrifugate) ed è ogni laboratorio a scegliere quale sia il percorso migliore (nell'emocromo non c'è bisogno della centrifuga mentre in chimica clinica è necessario centrifugare e in endocrinologia c'è bisogno di aliquotare perché ci sono tanti strumenti singoli). Su queste strumentazioni quindi il tecnico di laboratorio controlla che la destinazione delle provette sia giusta e controlla la manutenzione (per esempio la calibrazione delle pinze o del lettore).

Preanalitiche automatizzate

Negli ultimi anni anche la parte preanalitica è sempre più automatizzata. Oggi la preanalitica in alcuni laboratori dove c’è una grossa quantità di lavoro e la necessità di smistare tanto sono nate strumentazioni di laboratorio in grado di smistare, centrifugare e aliquotare (se necessario) costituite da vari moduli e di fatto queste strumentazioni sono anche legate agli altri macchinari del laboratorio (tramite delle catene con vari moduli) e a volte c’è anche uno storage (stoccaggio dei campioni dopo l’analitica → postanalitica). Fino a poco tempo fa la preanalitica era gestita da altre figure professionali alternative al tecnico di laboratorio, mentre oggi se la provetta è in catena e va direttamente nell’analizzatore e per questo motivo all’inizio della catena si ha bisogno di un tecnico di laboratorio (infermiere e OTL non possono dare un risultato e nemmeno una non conformità) con la nascita della figura del “tecnico supervisor” (inoltre, spesso c’è bisogno anche di manutenzioni strumentali di cui è responsabile il tecnico).

Fase analitica

La fase analitica inizia quando giunge a noi la provetta e finisce quando abbiamo il dato (nel frattempo il tecnico deve aver già acceso lo strumento che fa una autodiagnosi e i suoi controlli, in base al singolo laboratorio la presenza di reattivi a bordo o meno è diversa, infatti, lo strumento si può caricare la mattina stessa o la sera prima), la maggior parte dei sistemi di oggi sono collegati a sistemi informatici; bisogna sistemare lo strumento per l’analisi:

• Attivazione del collegamento analizzatori-sistema gestionale per acquisire le liste di esami e l’invio dei risultati (a meno che non sia operativo 24/24) e controllo del deposito dei reagenti a bordo
• Calibrare i sistemi (effettuare la calibrazione in cui non viene mai dato un valore diretto ma ricavato da un qualcosa costrutto da noi), spesso sulle grosse automazioni non si fa tutti i giorni (perché la curva di calibrazione può durare alcuni giorni)
• Verifica dei parametri delle calibrazioni eseguite
• Analisi del controllo di qualità interno (per vedere se ho fatto bene la calibrazione) e se ho dei problemi sulle calibrazioni o il controllo viene sballato non si passa alla seduta analitica
• Non ci basta che il controllo sia venuto bene ma ci interessa come è venuto rispetto ai giorni precedenti (l’andamento nel tempo)
• Se il controllo non viene bene si vanno a ricercare eventuali cause strumentali
• Si conclude con la validazione analitica da parte del tecnico

Ci possono essere poi delle problematiche in calibrazione e nei controlli. Bisogna poi (prima di caricare la provetta) se abbiamo per esempio 2 strumenti A e B uguali fatti lavorare entrambi questi strumenti devono essere allineati (ed è una valutazione che si fa nella fase analitica). Quando ottengo un dato posso avere dei flag che sono degli allarmi che io devo confrontare con le condizioni dello strumento (se ho lavorato con un controllo alto ma accettabile e mi viene creatinina sul valore di soglia è, comunque, un allarme).

Il dato analitico è il fulcro attorno al quale ruota tutta la fase analitica (si fanno calibrazioni, controlli, manutenzioni dello strumento e così via), intorno al dato analitico nell’arco degli anni si è creata sempre più attenzione, infatti, la qualità di un dato analitico si compone di diversi elementi:

• Accuratezza = quanto i dati si avvicinano al valore vero
• Precisione = quanto i dati si distribuiscono vicino al valor medio, la capacità di un metodo di fornire valori concordanti
• Rappresentatività del campione
• Specificità la proprietà del metodo per cui esso è in grado di misurare solo ed unicamente la grandezza per la quale è impiegato, un metodo è specifico quando non subisce interferenze da parte di altre sostanze
• Sensibilità è rappresentata dalla più piccola quantità di sostanza che si riesce a dosare, è strettamente correlata con la precisione

Fissati i parametri per cui uno strumento è sensibile, specifico ecc. si va a valutare un dato analitico, il dato che io eseguo comunque si trova dentro un certo range e può subire variazioni le cose che possono portare a questo sono: Metodo di misurazione se...