Prof A.Bedini - Analisi dei farmaci III e degli alimenti

Spettroscopia UV-Vis

UV 200-400 nm, Vis 400-800 nm. Spettroscopia di assorbimento molecolare che promuove cambiamenti dell’energia elettronica della molecola.

Come ben sappiamo, 200-800 nm. La spettroscopia UV-Vis è una tecnica di assorbimento molecolare usata in chimica analitica; quando un fotone ultravioletto o visibile viene assorbito da una molecola, questa passa dal suo stato elettronico fondamentale ad uno stato elettronico eccitato.

Ricordiamo che l’energia di una molecola è quantizzata. Energia totale è la somma dell’energia elettronica (UV) + vibrazione (IR) + rotazionale (microonde) + traslazionale + di spin nucleare (NMR).

Quindi l’interazione con queste radiazioni UV-Vis può provocare la transizione di un elettrone da un orbitale molecolare di legame o di non legame ad un orbitale di anti-legame vuoto e quindi il passaggio della molecola ad uno stato eccitato.

Trasmittanza e assorbanza

In spettroscopia la trasmittanza è la frazione di luce incidente ad una data lunghezza d’onda che attraversa un campione. Detto in parole semplici, è il rapporto tra l’intensità della luce P in uscita dalla cuvetta e l’intensità P0 della luce che entra/incidente: T = P/P0 e varia tra 0 e 1. P è il flusso della radiazione elettromagnetica, ossia la densità di corrente termica trasmessa. Se voglio conoscere la trasmittanza in %, basta fare T% = 100*T.

L’assorbanza invece è la quantità di luce che viene assorbita da un corpo. A = -log T (base 10) e varia da 0 a infinito. Quindi possiamo dire che sia T che A dipendono dalla radiazione impiegata.

Quando parliamo di uno spettro UV-Vis parliamo di un grafico dove si riporta l’intensità della radiazione assorbita dal campione (A) in funzione della lunghezza d’onda o frequenza della radiazione stessa. Ovviamente ogni sostanza ha un particolare spettro di assorbimento, e ciò ci permette di identificare una sostanza, confrontandola direttamente con campioni noti o con altre banche dati di spettri, o di controllarne il grado di purezza.

Legge di Lambert-Beer

È una relazione che correla la quantità di luce assorbita da un mezzo alla concentrazione ed allo spessore del mezzo attraversato. Ossia ci dice che l’assorbanza dipende dalla concentrazione dell’analita e dalla lunghezza del cammino ottico.

Ragioniamo: supponiamo che una luce monocromatica di intensità P0 colpisce una soluzione che è dentro una cuvetta. Sia l’intensità del raggio che emerge dalla parte opposta P, noi possiamo dire che P-P0 è la luce assorbita dal campione. Scriviamo quindi l’assorbanza come A = log P0/P.

Cosa ci dice la legge di Lambert-Beer? Che l’assorbanza è direttamente proporzionale alla concentrazione: A = K*b*c.

K è il coefficiente di assorbimento molare/assorbanza specifica, dipende dal tipo di solvente, dalla lunghezza d’onda e dalla specie chimica. b è il cammino ottico, ossia lo spessore della cuvetta che attraversa la luce (cm). c è la concentrazione della soluzione contenuta nella cuvetta (mol/L).

Trasmittanza vs concentrazione

La trasmittanza T non è lineare rispetto alla concentrazione e diminuisce in modo esponenziale in rapporto alla concentrazione c dell’analita ed alla lunghezza del percorso della luce b nel seguente modo: T = 10^-kbc.

Assorbanza vs concentrazione

Come abbiamo detto, l’assorbanza è direttamente proporzionale alla concentrazione, per cui la retta sarà lineare.

Assorbanza specifica o molare K

A = Kbc dove:

• C in g/L: K = a (assorbività).
• C in % p/v (g/100 ml): K = A (1%, 1 cm) o E (1%, 1 cm), assorbanza specifica/estinzione specifica.
• C in M (moli/L): K = ε, assorbanza molare/estinzione molare.

Queste costanti per specifiche lunghezze d’onda sono caratteristiche del composto in analisi, si riferiscono ad una cella di lunghezza 1 cm e dipendono anche dalla natura del solvente e dal pH.

Conversione con MW noto

Applicazioni in Farmacopea: nei prodotti farmaceutici, concentrazioni e quantità si esprimono in grammi o milligrammi piuttosto che in moli e quindi per l’analisi di questi prodotti la A di Lambert-Beer si scrive A = A (1%, 1 cm)*b*c dove A è l’assorbanza misurata, A (1%, 1 cm) è l’assorbanza di una soluzione all’1% p/v in una cella da 1 cm; b è il percorso (1 cm); c la concentrazione g/100 ml.

Linearità della legge di Lambert-Beer

La legge di Lambert è valida solo per le soluzioni diluite e per radiazioni monocromatiche.

Questa legge afferma che ci dovrebbe essere linearità tra la concentrazione e l’assorbanza, come abbiamo visto, poiché sono direttamente proporzionali. Succede però che in alcuni casi si hanno delle deviazioni della diretta proporzionalità tra queste due variabili, deviazioni che risultano tipo in una incurvatura verso l’alto, deviazione positiva, o verso il basso, deviazione negativa.

Aumentando la concentrazione, aumentano le forze interioniche e/o intermolecolari e possono formarsi molecole o aggregati di particelle più complesse, diverse per struttura da quelle in esame, per cui si potrebbe avere uno spostamento del massimo di assorbimento. E lo stesso aumentando sempre la concentrazione si ha un aumento dell’indice di rifrazione e quindi una maggiore dispersione del raggio nell’attraversare la soluzione stessa.

Rimane lineare fino a circa 1,5/2 unità di A. Non bisogna scendere troppo, 0,3-0,4, perché poi il rumore di fondo diventa consistente.

Le concentrazioni di 1-2 mg/100 ml sono sufficienti per composti fortemente assorbenti, A specifica = 1000-200.

Le deviazioni possono essere dovute:

• Fattori strumentali, come per esempio se si ha luce diffusa, ossia che la radiazione di lunghezza d’onda che giunge al rivelatore è diversa da quella selezionata, o la radiazione non è monocromatica.
• Fattori chimici, per esempio se il campione si dissocia o associa in soluzione o se il campione è fluorescente.

Possibili interferenze: bianco

Oltre che dall’assorbimento, la riduzione dell’intensità del raggio incidente può essere determinata anche da altri effetti che interferiscono nell’analisi, tipo:

• Riflessione della radiazione sulla superficie delle pareti della cella.
• Diffusione per la presenza di microparticelle, il soluto non è ben sciolto.
• Assorbimento da parte del solvente a basse.

Per compensare questi effetti si fa passare la radiazione incidente anche attraverso il bianco e poi si va a paragonare le due intensità.

Scelta della lunghezza d’onda analitica

Nell’analisi quantitativa è essenziale scegliere bene la lunghezza d’onda. Si sceglie di solito una che:

• Abbia la massima specificità.
• L’assorbimento sia massimo: per motivi di sensibilità, se l’assorbimento è elevato è possibile rilevare variazioni di assorbanza per definite variazioni di concentrazione dell’analita.
• Sia al centro di un picco largo: per motivi di precisione, piccole variazioni di portano a minimi errori sulla misurazione dell’assorbanza.

Attraverso questa legge, se la linearità è verificata sperimentalmente, si può determinare la concentrazione di un farmaco in un campione mediante misure di A di una sua opportuna soluzione.

Retta di calibrazione

Quando si ha una sostanza in esame e non si conosce la relativa assorbanza specifica si va a costruire una retta di taratura tra assorbanza e concentrazione. Si preparano una serie di concentrazioni note della sostanza in analisi pura e disciolta in un solvente, si fa il bianco con la cuvetta piena solamente di solvente e poi si va a leggere le varie assorbanze delle soluzioni a diverse concentrazioni.

Per determinare poi la concentrazione incognita del campione basta diluire la soluzione, determinare il valore di assorbanza e grazie alla retta creata andare a cercare il valore di concentrazione corrispondente.

La retta ha un’equazione y = a+bx; essendo lineare a = 0 si ha quindi y = bx. Il coefficiente angolare, pendenza della retta, equivale all’assorbanza molare se la concentrazione è M, all’A specifica (1%, 1 cm) se la concentrazione è % p/v.

Spettroscopia UV-Vis: aspetti pratici e strumentazione

Lo spettrofotometro UV-Vis è lo strumento utilizzato per l’analisi spettrofotometrica, è costituito da:

• Una sorgente che fornisce una radiazione continua sulle lunghezze d’onda di interesse.
• Un monocromatore che seleziona radiazione di diversa lunghezza d’onda dallo spettro della sorgente.
• Rivelatore che converte la radiazione elettromagnetica in energia elettrica, segnale.

L’intensità del raggio uscente P viene letta dal detector, ma quella del raggio incidente?

Si ipotizza T = 1 e P0 = P letto contro il bianco, azzeramento, poiché il bianco è privo di assorbimento, visto che non ha il soluto; l’intensità della radiazione che lo attraversa P0 corrisponde all’intensità del raggio di entrambe bianco e non.

Quindi l’intensità del raggio incidente è uguale a quello che si ha avuto precedentemente quando si è messo il bianco, solo avendo questa volta qualcosa disciolto nella mia soluzione che assorbe, il raggio in uscita P varia.

Sorgente

Lampada ad incandescenza.

Per il visibile la lampada a filamento di tungsteno (350-900 nm) dove l’emissione varia con la temperatura e non emette nella regione ultravioletta.

Lampada a deuterio (190-350 nm).

Questa lampada a deuterio o ad idrogeno non emette nel visibile ma sì nell’UV. Il bulbo della lampada è infatti riempito di questo isotopo che viene eccitato tramite scarica elettrica.

Monocromatore

È costituito da due parti: un elemento disperdente, un filtro ottico/banda passante. Esso riesce a scomporre la radiazione policromatica emessa in bande monocromatiche. Infatti queste diverse radiazioni policromatiche incidenti vengono deviate con angoli diversi e una di queste passa attraverso la fenditura.

Mezzo disperdente: il prisma è in grado di disperdere le radiazioni con diversa grazie al fenomeno della rifrazione: quando un raggio di luce passa da un mezzo ad un altro subisce una deviazione; ovviamente radiazioni con diversa hanno diversa deviazione.

I reticoli anche loro svolgono la stessa funzione del prisma, ma il loro funzionamento è basato sulla riflessione. Sono formati da dei solchi su una superficie lucida a distanza ravvicinata: il fenomeno è quello che si osserva guardando per obliquo un CD.

La banda passante e il mezzo disperdente influenzano la monocromaticità della radiazione.

Se la larghezza della fessura è troppo elevata si perde la monocromaticità, la K è riferita ad una specifica, e si perde la struttura fine nello spettro.

Se è troppo stretta si ha una riduzione dell’energia incidente, un più basso rapporto segnale/rumore e quindi una minor precisione. La farmacopea raccomanda.

La cella di lettura ossia la cuvetta

Si usano quelle usa e getta se siamo nel visibile, fatte di plastica o vetro, mentre ci sono anche quelle in quarzo. Contiene circa 3 ml di soluzione.

Rivelatore UV in cromatografia liquida

Ha configurazione a Z per aumentare il cammino ottico e quindi la sensibilità.

Solvente

Un requisito è che sia trasparente alla frequenza analitica. Per ogni solvente esiste una lunghezza d’onda minima, al di sotto della quale non può essere usato perché assorbe troppo. Se possibile meglio usare solventi non polari, in quanto le interazioni forti fra solventi polari e soluti comportano la perdita della struttura fine e quindi una perdita di informazioni utili.

Strumento a monoraggio o a doppio raggio

Lo strumento può essere a monoraggio o a doppio raggio.

Quello a monoraggio, l’assorbimento è letto solo su una cella ed è necessario il bianco di riferimento. È usato quando si deve fare una lettura ad una sola lunghezza d’onda, quantitativa, ma è difficile fare uno spettro.

Mentre per quello a doppio raggio l’assorbimento del bianco viene sottratto all’assorbimento della cella con il campione. Evita che si debba fare manualmente il continuo confronto con il bianco e legge continuamente la differenza fra la radiazione che passa per il campione e per il bianco. Le due intensità P e P0 raggiungono il dispositivo di lettura che poi determina il rapporto.

Il moderno strumento a monoraggio fa sì che il bianco venga registrato e mantenuto in memoria dalla macchina, poi si esegue la lettura della sostanza e calcola direttamente lui la differenza e mi dà direttamente lo spettro. Si può fare sia una lettura ad una frequenza, quantitativa, che ottenere l’intero spettro, qualitativa.

Il monoraggio a serie di diodi

DAD 190-800 nm.

Legge all’istante tutte le frequenze: ha centinaia di fotodiodi, che sono rivelatori, o meglio, sensori ottici che sfruttano l’effetto fotovoltaico per riconoscere una lunghezza d’onda incidente e trasformarla in un segnale elettrico.

Il vantaggio di ciò è la rapidità e riproducibilità di lettura istantanea di tutto lo spettro. Importante per le letture all’uscita di una colonna cromatografica dove queste devono essere effettuate in più fretta possibile.

Lo svantaggio è che si ha minore risoluzione, l’intensità della radiazione può decomporre la sostanza o dare fluorescenza anche se il tempo di esposizione del campione alla radiazione UV è comunque ridotto.

Spettroscopia UV-Vis: applicazioni

Aspetti qualitativi

La spettroscopia ci fornisce informazioni sul tipo di cromoforo, sistema di elettroni pi greco, atomi uniti da legami multipli, ed è un’analisi che molto spesso è prescritta dalla Farmacopea. λmax, λmin, Amax/Amin.

Schema generale: non esistono procedure standardizzate per identificare un cromoforo. In generale si deve tenere conto sia della complessità dello spettro, numero di bande, sia della loro intensità, valore di Kmax.

Ricordiamo che:

• Un sistema alifatico con coniugazione estesa o un sistema aromatico policondensato presentano molte bande strette nella regione del visibile.
• Un sistema con poche coniugazioni presenta una sola banda, o poche, nell’UV.
• Cromofori semplici, diene coniugato o chetoni alfa-beta insaturi, hanno valori di K compresi tra 10 000 e 20 000.
• Le transizioni n→π* danno valori di K basso, tra 10 e 100, nell’UV.
• I sistemi aromatici danno bande di intensità e posizioni diverse, K tra 1000 e 10000, sia nell’UV che nel visibile, in base ai sostituenti presenti nell’anello.
• Se si osserva uno shift batocromico e ipercromico nello spettro registrato in soluzione basica rispetto a quello in soluzione acida, si è probabilmente in presenza di un gruppo acido.
• Se, viceversa, si osserva uno shift ipsocromico e ipocromico, si è in presenza di un gruppo basico.

Effetto del pH

Anche il pH ha effetti nella spettroscopia come possiamo vedere nello spettro del paracetamolo. Curva A in soluzione acida, curva B in soluzione basica.

Analisi quantitativa UV-Vis di un principio attivo

Si procede a questa analisi grazie alla legge di Lambert-Beer in base all’assorbanza specifica di lettura, in riferimento ad uno standard, dopo estrazione per eliminare le interferenze e in seguito a derivatizzazione/complessazione.

Reazioni specifiche e analisi UV-Vis

Si procede a formare dei complessi grazie ai reattivi di shift AlCl3 e AlCl3/HCl.

Un esempio di analisi enzimatica UV-Vis è dell’acido urico dove in questo caso non è selettiva l’analisi UV ma la trasformazione enzimatica perché l’acido urico in presenza di uricasi forma allantoina e H₂O₂, dove H₂O₂ con etanolo subisce una catalisi ad acetaldeide. L’acetaldeide viene poi ossidata ad acetato grazie all’aldeide deidrogenasi liberando NADPH. La velocità di formazione del NADPH, misurata a 340 nm, è proporzionale alla quantità di acido urico presente nel campione.

Spettroscopia differenziale

Possiamo oppure avere, es. acido acetilsalicilico. Lo spettro UV dell’aspirina presenta due curve, quella A con soluzione acida mentre quella B con soluzione basica.

La spettroscopia UV-Vis è poi anche utilizzata per altre analisi di interesse farmaceutico come:

• La determinazione di pKa di alcuni principi attivi.
• Coefficienti di ripartizione.
• Solubilità dei principi attivi.
• Monitoraggio nel tempo del rilascio di un principio attivo.
• Cinetica di una reazione.
• Cinetica di una degradazione di un principio attivo.

Determinazione della pKa

La determinazione della pKa si può fare come già sappiamo attraverso l’equazione di Henderson-Hasselbalch dove pH = pKa + log (A-)/(HA).

Oppure mediante UV-Vis: dove questa formula può essere usata per un acido, mentre se il log lo sottrai per una base, dove un aumento del pH provoca un effetto batocromico/ipercromico. A è l’assorbanza misurata in un campo a pH noto alla lunghezza d’onda scelta per l’analisi. Ai è l’assorbanza della specie completamente ionizzata e An è l’assorbanza della specie non ionizzata.

Esempio nella fenilefrina: in soluzione basica si ha λ = 292 mentre in acido λ = 273.

Monitoraggio di reazioni chimiche

La spettroscopia UV-Vis può essere impiegata come metodica di monitoraggio di reazioni chimiche che coinvolgono parti della molecola che assorbono.

Es: la riduzione di C=O può essere seguita monitorando la graduale scomparsa della banda relativa del doppio legame C=O.

Alcune reazioni di cicl