Modulo di Microbiologia

Microrganismi cellulari procarioti

Sono distinti in due gruppi separati.

1900: cause di morte più comuni = malattie infettive.

2000: cause di morte più comuni = altre cause (malattie infettive quasi scomparse tra le cause di morte).

L’analisi filogenetica (RNA ribosomiale) ha portato a suddividere gli organismi viventi (cellulari) in tre gruppi evolutivi diversi detti domini degli organismi cellulari:

1. Bacteria (Batteri) Procarioti.
2. Archaea (Archea).
3. Eukarya (Eucarioti) Eucarioti.

Questo è dovuto a scoperte microbiologiche: prevenzione, trattamento, cura; e a trattamenti farmacologici (penicillina = 1º farmaco scoperto da Fleming nel 1929): antibiotici.

Non sono compresi gli organismi non cellulari come i virus, che hanno un’altra classificazione filogenetica.

Malattie infettive: dovute a VIRUS e BATTERI. Le malattie infettive rimaste nel 2000 sono solo di natura virale (AIDS e polmoniti/influenze).

L’uso di antibiotici ha portato a un ridimensionamento dell’incidenza delle infezioni batteriche, ma NON di quelle virali. L’incidenza delle infezioni virali è ridimensionata invece dall’uso dei vaccini. VIRUS ≠ BATTERI!

Classificazione degli organismi viventi

Tentativo di determinare un ordine nella diversità delle varie forme di vita identificando gruppi di individui accomunati da relazioni di affinità.

Specie.

Whittaker, 1951: classificazione a 5 REGNI: tiene conto dei microrganismi cellulari.

• BATTERI-Monera.
• Piante.
• PROTOZOI-Protisti.
• FUNGHI MONOCELLULARI (non sono cellule vegetali e sono eterotrofi!) - Funghi.
• Animali.

Analisi filogenetica = interpretazione in chiave evolutiva delle relazioni tra organismi, individuate mediante grado di identità delle sequenze di acidi nucleici. Gli individui sono legati dal grado di “somiglianza” nucleotidica.

Woese (anni ’70): analisi filogenetica degli organismi viventi mediante confronto delle sequenze di RNA ribosomiale: ha confrontato queste sequenze per creare degli alberi filogenetici.

Tre gruppi principali che spesso sono tre linee evolutive (non 2):

• EUCARIOTI A (sono procarioti ma hanno somiglianze con gli eucarioti => si staccano dai procarioti).
• EUCARIOTI B.

1) Bacteria (Batteri)

Enorme varietà di specie e ambienti colonizzati.

• Cellula procariote.
• Monocellulari (sempre!).
• Chemiotrofi; fototrofi (tipi di metabolismo).
• Peptidoglicano (NB: è esclusivo dei batteri come costituente della parete).
• Riproduzione asessuata.
• “Sensibili” agli antibiotici: non è una caratteristica strutturale, naturale dei batteri. Le stesse molecole sono infatti inutili anche in Archea.

Specie ambientali: solfobatteri, cianobatteri, ecc.

Specie ambientali, occasionalmente patogene: colera ecc.

Specie patogene a trasmissione interumana: difterite, meningococco, treponemi, ecc.

2) Archaea

Enorme varietà di specie e ambienti colonizzati. Batteri “ambientali”, non patogeni.

• Cellula procariote.
• Monocellulari.
• Chemiotrofi.
• Parete proteica (no peptidoglicano).
• Riproduzione asessuata.
• Insensibili agli antibiotici.

L’analisi dell’RNA ribosomiale ha evidenziato 3 “estremofili”:

• Ipertermofili: alte T (Pyrolobus: 90°C – 113°C).
• Alofili estremi: riproduzione in ambienti ad alta concentrazione di sale (Halobacterium: 15%-32%).
• Metanogeni: produttori di gas metano.

Questi gruppi vivono/si riproducono solo in questi ambienti/condizioni estreme.

Termofili/ipertermofili sono spesso utili alle biotecnologie:

• Thermus aquaticus (Bacteria): Taq DNA polimerasi, PCR.
• Pyrococcus furiosus (Archea): Pfu (vent) DNA polimerasi (High fidelity pol.), PCR ad alta fedeltà.

3) Eukarya (Eucarioti)

• Cellula eucariote.
• Monocellulari; pluricellulari.
• Eterotrofi; fototrofi.
• Parete derivata da glucosio che si distingue per le varie specie (chitina, cellulosa); oppure privi di parete (mai peptidoglicano).
• Riproduzione asessuata e sessuata.

Microrganismi eucarioti

A. Funghi

• Monocellulari = lieviti.
• Pluricellulari = muffe; funghi fruttiferi.
• Eterotrofi.
• Parete di chitina.
• Riproduzione asessuata e sessuata; spore.

Alcuni funghi sono utili (e utilizzati):

• Saccharomyces cerevisiae (lievito di birra).
• Aspergillus niger: ac. citrico.
• Penicillium: penicillina.

Alcuni funghi causano patologie (micosi):

• Candida.

B. Protozoi

• Monocellulari.
• Eterotrofi.
• Privi di parete.
• Riproduzione asessuata e sessuata.

I Protozoi sono normalmente ambientali:

• Paramecium.

Alcuni sono patogeni:

• Ameba.
• Plasmodium.
• Toxoplasma.
• Trypanosoma.

Microrganismi acellulari

Presentano un piano organizzativo subcellulare:

• Aggregati molecolari (virus).
• Singole molecole (viroidi, prioni).

Gruppo eterogeneo che include numerose e diversissime forme di organismi viventi (o non viventi):

• Organismi cellulari (in genere monocellulari).
• Particelle acellulari, infettive e patogene.
• Molecole infettive e patogene.

Non hanno capacità di vita autonoma: sono tutti parassiti e patogeni => si riproducono a spese della cellula ospite:

• Virus = aggregati proteici con acido nucleico; varie malattie infettive (virali).
• Viroidi = piccole molecole di RNA patogene per le piante.
• Prioni = particelle proteiche infettive trasmissibili in animali, compreso l’uomo; encefalopatie spongiformi (TSE), kuru, sindrome di Creutzfeldt-Jacob, BSE, mucca pazza.

NB: per microrganismi si intendono prettamente organismi unicellulari.

Microrganismi = tutti gli organismi microscopici (e submicroscopici) visibili solo al microscopio (ottico e/o elettronico). Si tratta di organismi aventi dimensioni dell’ordine di grandezza dei micron (o meno): micron (μ) = micrometro (μm).

• Protozoi > 10 μm.
• Funghi 8-10 μm.
• Batteri 0,5–4 μm.
• Virus 20–350 nm (< 0,5 μm). Quelli che interessano l'uomo sono di ~ 200-250 nm.

Struttura: acellulari, procarioti, eucarioti

Morfologia

Morfologia = studio della FORMA del microrganismo.

Osservazione dei microrganismi con adatti strumenti (NON sono osservabili ad occhio nudo a causa delle loro caratteristiche chimico-fisiche).

1. Composizione chimica: le cellule sono composte principalmente da acqua (~ 80% in peso) => scarsamente contrastate: manca il contrasto tra l'oggetto e lo sfondo (si vede tutto trasparente), sono visibili solo le cellule colorate naturalmente => naturalmente contrastate.
2. Dimensioni microrganismi, ordini di grandezza:

• Virus: nm (10^-9).
• Cellule: (10^-6) μm.

Hanno dimensioni inferiori al potere risolutivo umano (l'occhio umano visualizza da 0.1 mm in poi: può distinguere oggetti a distanze > 0.1 mm).

Problema: i microrganismi non si vedono a occhio nudo per:

• Assenza di contrasto.
• Ridotte dimensioni.

Soluzione: si devono ingrandire e rendere contrastati:

• Colorazioni.
• Microscopio.

NB: ingrandire non basta! Normalmente è necessario contrastare il campione.

Colorazione = tecnica di applicazione di una/più sostanze coloranti in grado di creare contrasto.

Cellula x ambiente: strutture cellulari (flagelli, parete, spora...).

Eccezioni alla regola:

• Microscopio in campo chiaro/scuro che consente di ingrandire l’immagine di elementi in genere poco contrastati.
• Campioni naturalmente contrastati.

La tecnica di colorazione può consentire di vedere la forma della cellula e le sue strutture => analizzare/classificare/diagnosticare a seconda dello scopo.

Colorazioni

1. Coloranti “ISTOLOGICI” = soluzioni contenenti pigmenti.
2. Molecole CROMOGENE/FLUORESCENTI legate a sonde specifiche (anticorpi, acidi nucleici): il legame anticorpo-proteina è altamente specifico e permette di individuare una particolare molecola/sostanza/organello cellulare.

A) Coloranti BASICI:

• Carica positiva.
• Colorano strutture acide (basofile): membrane, cromatina (es. cristal violetto, blu di metilene, safranina, fucsina basica).

B) Coloranti ACIDI:

• Carica negativa.
• Colorano strutture basiche (acidofile): proteine citoplasmatiche (eosina, fucsina acida, Rosso Congo).

Colorazione istologica = applicazione di uno/più coloranti tradizionali al campione fissato.

A) Colorazione semplice

Un solo colorante.

1. APPLICAZIONE campione su vetrino.
2. ESSICCAZIONE.
3. FISSAZIONE (implica sempre la morte del campione!).

• Fisica (calore).
• Chimica (solvente organico).

4. APPLICAZIONE del colorante (fase di colorazione vera e propria).
5. OSSERVAZIONE al microscopio ottico.

Tutti i microrganismi presenti sul vetrino appaiono colorati allo stesso modo e si vede solo la forma.

NB: la colorazione istologica consente solo la visione di campioni fissati = morti.

B) Colorazione differenziale/specifica

Diversi coloranti in successione che colorano selettivamente diversi tipi di cellule presenti nel campione (si usano determinati coloranti in un ordine specifico).

1. Colorazione di Gram

Consente di evidenziare due diversi tipi strutturali di batteri:

• Gram positivi = batteri blu (rispondono positivamente alla colorazione).
• Gram negativi = batteri rossi (rosso).

NB: se non rispondono alla colorazione non si possono definire né positivi né negativi!

FASI principali:

• Preparazione campione e fissazione (=> morte del campione, è istologica).
• Colorazione mediante applicazione in successione di 2 diversi coloranti basici:

1. Applicazione del 1º colorante = colorante basico blu (es. Cristal violetto, Violetto di genziana).
2. Utilizzo di un mordenzante: si ha la fissazione e le cellule rimangono tutte blu (soluzione iodio/KI).
3. Decolorazione (alcool/acetone o entrambi) => in questa fase si osserva che alcuni batteri rimangono colorati di blu, altri si decolorano.
4. Applicazione del 2º colorante = colorante rosso (basico) (Safranina, Fucsina) => i batteri che hanno mantenuto la colorazione blu dopo la decolorazione, rimangono colorati di blu. Si colorano di rosso solo i batteri che si erano decolorati (trasparenti).

Queste colorazioni dipendono dal tipo di parete e alla fine nello stesso vetrino si vedono batteri blu e rossi che hanno parete differente.

2. Colorazione di Ziehl Neelsen/di acido resistenza

Colorazione differenziale selettiva per batteri acido resistenti (micobatteri).

1. 1ª applicazione: colorante basico rosso (Fucsina basica).
2. Decolorazione con alcool + acido.
3. 2ª applicazione: colorante blu basico di metilene.

In base al risultato finale si definiscono:

• Batteri rossi = acido-resistenti e rispondono positivamente alla colorazione.
• Batteri blu = non acido-resistenti.

NB: Colorazione semplice e colorazione differenziale:

• Colorazione SEMPLICE: Meningococco e Pneumococco diplococchi.
• Colorazione DIFFERENZIALE (Gram): Meningococco cocchi Gram negativi (rosso); Pneumococco cocchi Gram positivi (blu).

3. Colorazione vitale istologica

• Coloranti non tossici.
• Osservazione campione fresco (vivo).
• Distinzione tra cellule morte e vive (per vedere l'effetto tossico di certe sostanze).

Rosso Neutro: assunto attivamente dalle cellule vive => colorazione delle cellule vive, ma non delle morte.

Osservazione microscopica dei microrganismi

Osservazione microscopica dei microrganismi: analisi dei microrganismi mediante l’uso di strumenti che permettono di ingrandire l’immagine del preparato, dal momento che l'occhio umano ha il suo potere risolutivo (ha una certa capacità di ingrandire l'immagine dell'oggetto osservato).

I sistemi di ingrandimento utilizzati sono principalmente i microscopi ottici ed elettronici.

A. Microscopio ottico

Usato in microbiologia tradizionale.

• Sorgente luminosa = luce visibile.
• Sistema di ingrandimento = lenti di vetro.
• Ingrandimenti max. = 1000 x.
• Risoluzione = 0,2 μm.
• Sistemi di lenti = 2 oculari (ingrandimento fisso = 10 x) + obiettivi (ingrandimento che varia da 50 a 100 x). => Ingrandimento finale = prodotto dell’ingrandimento delle singole lenti (es. obiettivo 40X e oculare 10X = 400X).

B. Microscopio elettronico

• Sorgente luminosa = fascio di elettroni.
• Sistema di ingrandimento = magneti.
• Ingrandimenti: 100.000 X (SEM) e 1.000.000 X (TEM).
• Risoluzione: 0,2 nm.

Colorazione non necessaria.

Alcuni tipi di microscopio ottico

• Microscopio in campo chiaro = contrasto naturale.
• Microscopio in campo oscuro.
• Microscopio a contrasto di fase.
• Microscopio a fluorescenza.

1) Microscopio in campo chiaro

“Classico”. Analisi immediata.

Osservazione diretta del preparato.

• La luce bianca incidente attraversa sia il campione che lo sfondo => se non c'è un contrasto naturale non vedo il campione.
• Sia l’oggetto che lo sfondo sono illuminati.
• Assenza di contrasto.
• Il campione deve essere colorato (colorazione semplice/differenziale). La colorazione serve a trasformare la luce bianca incidente sul campione in luce colorata.
• Campioni fissati (morti).
• Usato anche per la visione di campioni colorati naturalmente senza la colorazione (batteri come cianobatteri - batteri fotosintetici; e alghe unicellulari - hanno forme molto simmetriche e vengono colorati sui cloroplasti).

2) Microscopio in campo scuro

Sfrutta un sistema di specchi che riflette la luce.

• La luce incidente colpisce il campione ma non penetra nell’obiettivo.
• Entra nell’obiettivo solo la luce riflessa (quella che si vede).
• Il vetrino appare buio perché non attraversato da luce incidente => risultato = campione illuminato su sfondo scuro: contrasto naturale.
• Colorazione non necessaria => si possono vedere anche cellule non fissate, vive.

3) Microscopio a contrasto di fase

Il più utilizzato.

• La luce incidente attraversa il campione: raggi che attraversano strutture cellulari = ritardati; raggi diretti.
• Si crea un gioco di ombre: si vede il campione vivo, non fissato, ma in bianco e nero “sfumature di grigio”, colorazione non necessaria, osservazione delle colture cellulari.

NB: Microscopi in campo scuro e a contrasto di fase: osservazione di:

• Campioni non colorabili agevolmente.
• Campioni freschi e vitali.
• Analisi immediata.
• Mobilità dei batteri.

4) Microscopio a fluorescenza

Fenomeno della fluorescenza = analisi di microscopia ottica basata sull’uso di sostanze fluorescenti.

Coloranti fluorescenti (Fluorocromi) = sostanze che assorbono radiazione a una data λ ed emettono a una superiore:

• Fluoresceina (FITC) gialla-verde.
• Rodamina rossa.
• DAPI blu.
• Acridina orange arancione.
• Bromuro di etidio rossa-arancione.

Sono molecole costituite da molte strutture ad anelli aromatici.

• È un microscopio ottico con sorgente luminosa a bassa λ (raggio UV).
• NB: il raggio UV incide sul preparato ma poi è bloccato da un filtro di sbarramento => non attraversa l’obiettivo.
• Penetra nell’obiettivo solo la fluorescenza (luce visibile) emessa dal campione marcato con il fluorocromo.

Filtro di eccitazione λA => campione => filtro di sbarramento λE.

Se prendo una molecola ad anelli aromatici, si dice che il campione è colorato.

• Se accendo una luce bianca, vedo il campione bianco.
• Se accendo i raggi UV, il campione si colora di fluorescente => si vede solo al buio.

Non vedo un campione colorato istologicamente: se spengo i raggi UV non vedo più il campione.

Microscopio elettronico

1. A scansione (SEM): campione intero.
2. A trasmissione (TEM): campione sezionato.

Raggio incidente = fascio di elettroni => campione => schermo fluorescente/fosforescente; quella che vede l'operatore è l'immagine in negativo sullo schermo.

Problematiche

A. Il fascio di elettroni può attraversare solo materiale di spessore molto ridotto (pochi nm) => il campione deve essere tagliato in sezioni sottili mediante microtomi (TEM).

B. I tessuti biologici e le cellule sono però normalmente molli prima del taglio => il tessuto deve essere indurito.

Indurimento

• Fissazione (glutaraldeide, OsO₄).
• Inclusione (resina Epon, Araldite): si include del campione in una resina.
• Congelamento: poi però il campione deve essere mantenuto congelato per tutto il corso