Modulo diagnostica

Diagnosticagelfesami di laboratorio

La biochimica clinica

La biochimica clinica è differente dalla biochimica, sono complementari ma non sovrapponibili. La biochimica clinica è una scienza applicata, segue gli effetti della malattia e dei farmaci → sono monitorati i processi biochimici di organi e tessuti esaminando materiale biologico: si determinano la quantità delle sostanze e le proprietà specifiche. Lo scopo principale di tutto ciò è quello di prevenire, diagnosticare e curare uno stato di malattia. Alla biochimica è aggiunta la complessità umana.

Utilità della biochimica clinica

Serve per:

• Classificazione nosografica, cioè consente di separare condizioni apparentemente simili sul piano clinico, ma diverse sul piano fisiopatologico.
• Fornisce dati statisticamente significativi, quindi che posso considerare come validi, tenendo conto, ad esempio, della variabilità dei caratteri biologici di una certa popolazione.
• Permette il controllo e l’aggiustamento della posologia dei farmaci (bambini, anziani, gestanti).
• Controlla i fattori di rischio ambientale (tossicità da piombo, solventi organici, pesticidi).

Tipologie di esami richiesti

Gli esami vengono richiesti per utilità per pz, medico e collettività. Sono richiesti:

• Profili biochimici: posso ricostruire funzionalità d’organo.
• Prove di funzionalità (es. reni).
• Screening.
• Esami d’urgenza: sono richiesti quando il pz arriva a ER → informazioni da dare in poco tempo.

Profili biochimici

Non si dosa mai una molecola sola ma si misurano due o più sostanze tra loro correlate. Sono ad esempio:

• Elettroliti plasmatici (sodio, potassio, cloruro, bicarbonati).
• Proteine plasmatiche (proteine totali, rapporto albumina/globulina, profilo elettroforetico).
• Test di funzionalità epatica (bilirubina, ALT, AST, ALP, proteine plasmatiche, test su più enzimi della coagulazione).
• Quadro del calcio (calcio, fosfati, ALP).

Prove di funzionalità

La perdita o l’alterazione delle capacità dell’organismo a reagire a determinati stimoli esterni può rappresentare una causa di malattia o costituire un fenomeno secondario utile per evidenziare lo stadio iniziale della malattia. Es. la funzionalità dinamica (test di tolleranza al glucosio usato molto nei pazienti con sospetto di diabete), funzionalità epatica o funzionalità renale (glomerular filtration rate).

Screening

Sono eseguiti su soggetti asintomatici, sono fatti per stabilire eventuali possibilità di insorgenza di una malattia potenzialmente invalidante. Sono perlopiù screening neonatali. Sono fatti:

• Galattosemia: capacità di smaltimento di una serie di metaboliti.
• Intolleranza al glucosio.
• Fenilchetonuria.

Sono malattie che, se diagnosticate immediatamente e trattate con diete specifiche, permettono crescita regolare. Sono eseguiti per il monitoraggio di soggetti esposti a sostanze tossiche:

• Piombo, mercurio, pesticidi.
• Solventi organici.
• Ossidi di carbonio.

Esami di urgenza

Sono esami da fare in 10-60 min, riguardano analiti il cui referto deve essere fornito subito → si istituisce una parte di laboratorio atta solo agli esami di urgenza.

Prelievo e conservazione dei campioni biologici

Prelievo

Possiamo avere risultati importanti quando si utilizzano tecnologie standardizzate → parte analitica (macchine controllate) e prelievo (metodo di campionamento) → dobbiamo avere riproducibilità di risultati.

La maggior parte degli errori avvengono in fase preanalitica → fase in cui si preleva il campione. Prima del prelievo è fatta una disinfezione, vengono usati strumenti sterili. Si preleva sangue venoso → vena cubitale. In pz obesi, anziani o trattati con chemio si preleva dal dorso della mano. Si può fare prelievo di sangue capillare come nei bambini. Si può fare prelievo di sangue arterioso → poco usato, si creano danni (trombosi ed ecchimosi), tutte le informazioni ottenute sono uguali a quelle del venoso, si possono ottenere info in più su concentrazioni di gas (ci sono altri metodi).

Tipi di campioni

Otteniamo sangue intero che raccolgo in provette con anticoagulanti. Il plasma è uno dei materiali più usati → necessario anticoagulante, il plasma è tale perché contiene tutte le proteine delle coagulazione. Se non ho l’anticoagulante, il sangue coagula → ottengo siero: è privo di pp della coagulazione. Se raccolgo plasma metto anticoagulante, se raccolgo siero non devo mettere additivi. Vengono usate provette a pressione negativa (vacutainers) → prelevano il quantitativo corretto. Questo garantisce che i volumi del campione siano costanti e che il rapporto tra anticoagulanti e sangue sia costante (si agita e basta).

Ogni provetta deve avere un’etichetta non staccabile che contiene le info necessarie per identificazione di pz ed esame. Gli anticoagulanti sono liquidi e sono eparina, citrati, ecc. → vanno scelti in base all’esame.

Dispositivi

Il laccio va posto sopra la fossa cubitale e si mette per 30 s-1 min per favorire il drenaggio del sangue nella siringa, se lo tengo troppo la composizione è alterata. Tutto deve essere standardizzato. L’ago butterfly è usato per prelievi dal dorso della mano, è usato perché è molto sottile → prelievo non invasivo. I tappi sono colorati in maniera diversa e hanno un codice universale: ovunque nel mondo è usato questo codice→ a ogni colore corrisponde un additivo e un gruppo di esami che può essere fatto con quel campione. Il sangue viene poi centrifugato → separo parte corpuscolata da parte fluida.

Preparazione pz

Il pz deve prepararsi all'esame → vanno evitate alcune azioni per ottenere risultati veritieri:

• Niente esercizio fisico per i 3 gg precedenti.
• Digiuno per 12h.
• Non fumare per 6h.
• Pz deve stare sdraiato per 15 min → cambiano i componenti del sangue.

Emolisi

L’emolisi è la rottura dei globuli rossi → il contenuto viene rilasciato all’esterno, quando centrifugo il battente fluido risulta rosa o rosso a causa della rottura dei globuli rossi. Inoltre i globuli rossi contengono enzimi contenuti nel plasma → risultano aumentati alcuni enzimi. I campioni emolizzati vanno scartati. Campioni prelevati dal dorso della mano sono maggiormente emolizzati. Circa il 3.3% di tutti i campioni in routine sono emolizzati → non idonei. Anche campioni lipemici sono scartati → sono casi rari. Con lisi dell’1% dei globuli rossi abbiamo ad esempio LDH che aumenta del 270% ecc.

Prelievo sangue capillare

Il sangue capillare è usato per bambini, anziani, pz sottoposti a chemio (vene fragili) e monitoraggio di alcune molecole con POCT. Non bisogna "spremere" il dito → alterazione composizione, è meglio scaldare a 41°C perché si crei vasodilatazione. Le differenze fra il sangue venoso e arterioso si traducono in differenze a livello della composizione proteica e dei gas.

Errori

Il 65% degli errori sono preanalitici → criteri standardizzati; nel laboratorio di analisi è tutto standardizzato → riduzione degli errori (-15%); altri errori sono fatti in fase post analitica (intervento umano).

Tipologie di campioni

Sono raccolti sangue, fluido cerebrospinale, urine, saliva, feci, liquido amniotico e liquido sinoviale.

Sangue

Il plasma è il fluido che si trova sopra la parte corpuscolata dopo centrifugazione (55% del sangue), contiene tutte le pp della coagulazione (raccolgo con anticoagulante). Sul fondo si trovano eritrociti, a metà abbiamo il buffy coat, sopra c’è il plasma (contiene moltissime informazioni). Se non interessano le pp della coagulazione, raccolgo campione e aspetto → formazione del coagulo. Centrifugo ed ottengo coagulo con piastrine, globuli rossi ecc. sul fondo.

L'ematocrito permette di misurare il quantitativo di globuli rossi in relazione al prelievo eseguito. Il sangue è raccolto dall’orecchio usando un capillare che contiene anticoagulante (eparina) → il sangue non coagula. Pongo il capillare in sistemi da centrifuga, sul fondo abbiamo globuli rossi e si misura il rapporto tra globuli rossi e totale del prelievo. L'ematocrito aumenta ad esempio in caso di doping. Non tutte le analisi si fanno su tutte le provette. Utilizzo certe provette con un determinato anticoagulante piuttosto che un altro→ non tutti gli esami possono essere ad esempio condotti in provette con eparina o citrato o ossalato.

Bisogna tenere conto del turn around time → tempo che intercorre tra il momento in cui il medico emette richiesta e il momento in cui il pz ottiene una risposta. I prelievi chiudono alle 10 perché alle 10 inizia l’analisi di tutti i campioni → poi dà il risultato in 1-2 h. Dopo le 10 entrano solo i prelievi d'urgenza. Viene usato il plasma al posto del siero → 30 min per aspettare la coagulazione in caso di siero. Le analisi che possono essere sviluppate sul plasma sono favorite → risparmio tempo in raccolta e processamento.

Provette e loro utilizzo

• Provette con tappo rosso: Non hanno né anticoagulanti né conservanti. Sono usate per raccogliere il siero. In clinica si predilige l’uso di plasma.
• Provette con tappo grigio: Sono usate per dosare il glucosio → il glucosio viene modificato nel tempo, la concentrazione diminuisce rapidamente → la glicolisi continua ad andare avanti. Contengono inibitori della glicolisi che sono fluoruro di sodio e ossalato di potassio che inibiscono l’enolasi mentre il sodio iodoacetato inibisce la glucosio 3 fosfato deidrogenasi.
• Provette con tappo verde: Contengono sale di Na, K o di Li dell’eparina → anticoagulanti, danno plasma. Non possono essere usate per misurare Na, Li e K. L’eparina può influenzare la dimensione e l’integrità dei componenti cellulari del sangue e non è raccomandato per gli studi di ematologia.
• Provette con tappo lavanda: Contengono EDTA come anticoagulante, EDTA chela calcio e inibisce la coagulazione. Usato per ematologia, non usato per dosare Ca e K.
• Provette con tappo azzurro: Contengono citrato di sodio, che chela il calcio e inibisce la coagulazione. Utilizzato per studi di coagulazione perché facilmente reversibile. Usato per monitorare i livelli di pp della coagulazione.

Liquido cefalorachidiano

È prelevato fra 4 e 5 lombare, serve per numerose diagnosi → utilizzo aumentato. Si cercano bm in qualcosa vicino ai centri nervosi. Viene raccolto in determinate limitate quantità. Comitati etici poco propensi a questo tipo di raccolta. Vengono usati in ricerca prelievi fatti già di routine. Si prelevano 3-4 ml, il primo ml è emolizzato. È usato per studi di immunologia, citologia chimica, microbiologia e biologia molecolare. I test sono basati sulla contaminazione batterica → in caso di meningite caratterizzazione di battere o virus. È usato per studi per la diagnosi in pz con sclerosi multipla. Si cerca di sfruttare questo fluido per la ricerca di bm specifici per malattie come Alzheimer e tutte le demenze. È un fluido la cui raccolta, trasporto e conservazione devono seguire regole precise per ottenere campione utilizzabile.

Viene messo un ml per provetta:

• 1: chimica e immunologia
• 2: esame microbiologico
• 3: conta cellulare
• n: biobanca

Deve essere analizzato entro un’ora dalla raccolta → degradazione. Se devo street RNA devo farlo il prima possibile e conservarlo a -20 o -80°C. Si fanno centrifugazioni e poi si ricevano batteri o conservano diretto a -80 e usato per analisi di ricerca.

Urine

Vanno raccolte nelle prime ore del mattino, non possono essere conservate per più di due ore e soprattutto non vanno conservate in frigorifero→ precipitazione e alterazione della composizione. Dalle urine si possono ricavare molte informazioni → ce ne sono in abbondanza. Sono analizzate in base al colore e odore, se è necessaria la sterilità del campione si utilizza ago aspirato.

• Analisi macroscopica: la torbidità è dovuta a cellule o cristalli. Elementi cellulari e batteri vengono eliminati per centrifugazione. Se sono cristalli si sciolgono per aggiunta di acidi e basi forti. Se sono batteri si passa all’esame microscopico ed eventualmente alla coltura.
• Analisi chimica tramite dipstick: strisce di cellulosa impregnata di reagenti (è un POCT). Per esempio per valutare la quantità di glucosio→ reagisce in presenza di glucosio ossidasi con acqua e dà origine ad acido gluconico e ad H₂O₂. Questa reagisce con lo ioduro di potassio presente nella cellulosa dove è presente anche la perossidasi di rafano. A questo punto si crea lo ioduro di potassio che sviluppa colora e quindi il test in 30 secondi può essere discriminante.
• Analisi microscopica.
• Coltura.
• Analisi citologica.

Liquido sinoviale

È un ultrafiltrato plasmatico contenente ialuronoproteine prodotto dalle cellule che rivestono internamente la membrana sinoviale delle grosse articolazioni. Ha uno scopo lubrificante e nutritivo nei confronti delle cartilagini che rivestono i capi articolari delle ossa. Lo studio delle sue caratteristiche chimiche fisiche e citologiche è di grande utilità per l’orientamento diagnostico e terapeutico. Usato per esempio per artrite reumatoide. Si ottiene mediante puntura percutanea e aspirazione con siringa in provette contenenti anticoagulante → se ci sono globuli rossi o proteine della coagulazione potrebbe precipitare. La ricerca dei cristalli di acido urico per le diagnosi di gotta deve essere condotta entro poche ore dal prelievo che non deve essere posto a bassa temperatura.

Liquido amniotico

Permette:

• Di valutare la funzionalità e la maturità degli organi e apparati fetali (apparato digerente, urinario, respiratorio).
• Di rilevare malformazioni fetali.
• Di accertare precocemente malattie genetiche o cromosomiche.

È eseguito mediante puntura transaddominale del sacco amniotico e aspirazione con siringa, si effettua dopo la XII settimana. Non si utilizzano anticoagulanti. Se richiesto il dosaggio della bilirubina le provette devono essere scure o oscurate.

Feci

La raccolta è standardizzata → device che raccoglie in maniera pulita sterile. I campioni di feci permettono:

• Dosaggio di sangue occulto nelle feci.
• Test per malassorbimento.
• Studio microbioma.
• Monitoraggio funzione pancreatica.
• Dosaggio calprotectina.
• 1 tripsinaα.
• Test di microbiologia.

Le feci contengono molte informazioni:

• Cibo non digerito e acqua.
• Enzimi digestivi (dal pancreas come la tripsina, l’elastasi).
• Enzimi dalle membrane intestinali come maltasi, isomaltasi, lipasi, peptidasi.
• Molecole infiammatorie come calprotectina e lattoferrina → usate per la diagnosi di malattie infiammatorie intestinali. La calprotectina nella diagnostica ha elevate sensibilità (90% negli adulti e >95% nei bambini), cambiando così la diagnostica dell’IBD, evitando la colonscopia.
• Emoglobina.
• Immunoglobuline, es. IGA secrete localmente.
• Alterato contenuto di fibre e lipidi.
• Microbiota intestinale o patogeni (identificazione diretta di microorganismi) o antigeni come ad esempio helicobacter o DNA).
• Cellule (immunocellule o cellule intestinali).

Saliva

Non esistono attualmente criteri di raccolta uniformi. Il più semplice è drenare il flusso passivo e naturale della saliva dalla bocca in contenitori di vetro o plastica. Una raccolta più precisa prevede la sua aspirazione dai dotti di uscita delle grosse ghiandole salivari. L'assorbimento con dispositivo tipo cotton fioc dipende dall’operatore (va posizionato in specifiche aree), la raccolta con salivette dipende dalla masticazione dei salivette ed è sconsigliato, in quanto comporta il rischio di assorbimento permanente di alcune sostanze da parte del cotone stesso. Non si utilizza il cotone perché trattiene alcune sostanze. È usato per abuso d’alcol, Alzheimer, fibrosi cistica, sindrome di Sjorgen e Covid-19.

Importanza della standardizzazione

Molto spesso nell’ambito della ricerca, i ricercatori stessi per ottenere un certo numero di campioni devono accedere a ospedali diversi. Quindi variando le variabili pre analitiche (parametri come le provette, gli additivi, la tempistica e la velocità di centrifugazione) si osservano dati diversi. Si analizzano i controlli di specifici esami e sono diversi tra loro → la standardizzazione è necessaria!!

Biobanche

Prevede la raccolta di campioni biologici (umani, animali, vegetali). È un deposito che accetta, elabora, archivia e distribuisce biocampioni e i dati ad esse associati. Nascono come collezione privata con piccoli depositi, prevalentemente universitari, sviluppati per le esigenze di ricerca. La loro evoluzione include archivi istituzionali supportati dal governo, biorepository commerciali (a scopo di lucro), biobanche basate sulla popolazione e, più recentemente, biobanche virtuali. Il termine è stato introdotto nel 2001, è una persona giuridica che svolge attività di biobancario, può avere o meno laboratorio, se ha un laboratorio e ricevere campioni può anche fare delle analisi. I clienti sono laboratori di ricerca, clinici, ricercatori universitari, ricercatori industriali.

Le biobanche sono nate perché i dati sono irriproducibili. Il costo annuo dovuto ai risultati irriproducibili della ricerca è negli USA di 28 miliardi all'anno. La maggior parte è dovuta al materiale biologico sbagliato e all'errata raccolta di campioni che arrivano sul banco del ricercatore:

• Soggetti oncologici, maschi, soggetti di controllo femmine (criteri di inclusione errati).
• Campioni oncologici da una clinica, campioni di controllo da diverse cliniche (raccolta errata).
• Campioni oncologici conservati per 10 anni, campioni di controllo per 1 anno (conservazione errata del campione).

Il core business della biobanca è mettere a disposizione campioni raccolti e conservati con metodi standardizzati. La biobanca si occupa del:

• Controllo della preparazione del campione.
• Convalida iniziale (e continua) dei metodi di elaborazione.
• Caratterizzazione.