Microbiologia - parte 1

Biologia dei microrganismi

Biologia dei microrganismi, esseri viventi piccolissimi di dimensioni tra le 0.5 e le 30 micrometri, che possono essere uni/pluricellulari o virus. Le ridotte dimensioni permettono ai microrganismi di essere concentrati in spazi molto piccoli, miliardi di cellule per ml o colonia, 10.

Tematiche della microbiologia

La microbiologia si basa su due tematiche complementari:

• Scienza biologica di base: Strumento di studio dei processi vitali, microrganismi:
  • Sistemi biologici semplici.
  • Modelli per studi biochimici e genetici.
• Scienza biologica applicata: studio dell’utilizzo dei microrganismi nei processi industriali, agricoli, medici:
  • Il loro ruolo in natura, es. cicli biogeochimici, O2 e N2 in atmosfera.

Impatto sull’uomo

I microrganismi hanno un grande impatto sulla nostra vita:

• Agricoltura: la simbiosi tra ruminanti e microorganismi presenti all’interno dell’apparato digestivo, grazie ai quali sono in grado di digerire la cellulosa, idrolizzazione.
• Produzione di cibo: molti microrganismi sono utilizzati nei processi fermentativi.
• Ambiente: utile nella produzione di biocarburante o nel biorisanamento.
• Biotecnologie: utilizzati nella produzione di farmaci e nella terapia genica.
• Malattie: possono causare patologie gravi. Un esempio è la malaria provocata dal plasmodium spp. I vettori del plasmodium sono le zanzare, all'interno delle quali ha luogo una prima parte del ciclo vitale del plasmodium.
• Arte: hanno un effetto importante anche sui beni culturali. Grazie alla loro ampia versatilità metabolica e alla loro capacità di insediarsi su superfici di qualsiasi tipo, i microrganismi sono stati in grado di arrivare a colonizzare anche manufatti colturali causando spesso danni estesi e irreversibili, come le muffe nere che causano l’annerimento delle statue.

Storia della microbiologia

La scoperta dei microrganismi è correlata all'invenzione dei microscopi ottici.

Galileo fu il primo a provare di osservare i microrganismi ma fallì a causa dell’assenza di lenti adeguati.

Robert Hooke riuscì ad osservare le muffe, 1664. Colui che riuscì per primo nell’impresa però fu Van Leeuwenhoek che diede indirettamente avvio alla microbiologia. Si costruì delle lenti per osservare le stoffe e osservò gli animalcula.

Un'altra tappa storica è legata a Pasteur, 1822-1895, il quale attraverso un esperimento spiegò l'erroneità della generazione spontanea. Egli dimostra che la degradazione avveniva per via dei microrganismi presenti nell'ambiente, veicolati dal pulviscolo.

Pasteur riesce anche a dimostrare che si ha la fermentazione alcolica e che altre fermentazioni erano il risultato di attività microbica e riuscì a sviluppare il processo di pastorizzazione.

Altri importanti studi sono stati quelli di Koch, 1843-1910. Egli formulò i postulati di Koch, attraverso i quali possiamo determinare se una malattia è associata a microrganismi:

1. Il microrganismo presente negli animali malati e assenti in quelli sani.
2. Il patogeno deve poter essere coltivato in coltura pura.
3. Le cellule coltivate in coltura pura devono poter indurre la malattia in animali sani.
4. L'organismo deve poter essere isolato e deve essere identico all’originale.

Il lavoro di Koch ha permesso la scoperta e lo sviluppo di attrezzature oggi utilizzate nel laboratorio quali: l'agar, piastre di Petri, le metodologie per isolare i microrganismi e scoprì il bacillo della tubercolosi.

La cellula

Una cellula è caratterizzata da funzioni specifiche che le rendono uniche:

• Metabolismo: Assunzione di sostanze chimiche dell'ambiente, loro trasformazione all'interno della cellula ed eliminazione dei prodotti di rifiuto nell'ambiente. La cellula è un sistema aperto.
• Riproduzione, crescita: Le sostanze chimiche assunte dall'ambiente sono utilizzate dalle cellule per fabbricare nuove cellule.
• Differenziamento: Formazione di una nuova struttura cellulare, come per esempio una spora, generalmente nell'ambito del ciclo di vita cellulare. Questo processo è controllato dalle informazioni presenti nel genoma.

1 Il motivo per il quale gli organismi sono così piccoli è per rispettare il rapporto superficie volume: più l’organismo è piccolo e maggiore è il suo potenziale metabolico.

2 Lavorò molto con il batterio della tubercolosi.

3 Grazie alla membrana selettiva.

4 Nei microrganismi le cellule non si devono differenziare anche se esistono casi quali le endospore, formano un concentrato cellulare con funzione di resistenza, e i funghi, da micelio in carpoforo.

• Comunicazione: Le cellule comunicano o interagiscono soprattutto per mezzo di sostanze chimiche rilasciate nell'ambiente o assunte da questo.
• Mobilità: Gli organismi viventi sono spesso in grado di muoversi autonomamente grazie ad appendici, ciglia/flagelli.
• Evoluzione: Le cellule evolvono e acquisiscono nuove proprietà biologiche. Gli alberi filogenetici mostrano le relazioni evolutive tra cellule.

Il macchinario cellulare è costituito da due aspetti:

• Metabolismo: attraverso il quale la cellula è in grado di produrre energia, ATP, molecole ed enzimi che catalizzano le reazioni.
• Corredo genetico: che serve alla cellula per la replicazione, attraverso il quale l'informazione genetica viene trasferita da una cellula madre alle cellule figlie.

Le prime forme microbiche risalgono a 3,5 miliardi di anni, erano fotosintetizzanti. Con il tempo questi microrganismi si sono andati a stratificare, cristallizzazione, formando dei feltri microbici. Un esempio sono gli stromatoliti, strutture sedimentarie calcaree derivate da filtri microbici.

Questi primi organismi, definiti produttori primari, producevano sostanza organica come fonte di scarto, che veniva usata poi come nutrimento da organismi secondari.

Acqua e macromolecole

Ogni cellula racchiude all'interno macromolecole che costituiscono il 96% della cellula, il restante 4% sono elementi minerali. Queste macromolecole sono un insieme di elementi tenuti insieme da legami:

• Covalenti più compatti.
• Idrogeno, che legano le molecole in maniera meno forte, esempio l’H2O, catena amminoacidica e le basi azotate.
• Forze di van der Waals, interazioni idrofobiche e legami ionici, legami deboli.

All'interno della cellula incontriamo macromolecole associate a diversi comparti:

• Proteine del flagello, della parete cellulare, membrana citoplasmatica e nel citoplasma.
• Acidi nucleici sono presenti nel nucleoide, DNA, e nei ribosomi, RNA.
• Polisaccaridi nella parete cellulare e in inclusioni, vacuoli per gli eucarioti e granuli per i procarioti.
• Lipidi nella membrana citoplasmatica, parete cellulare e sotto forma di inclusioni.

Zuccheri

Zuccheri: Rapporto 1:2:1, C:H:O. Queste molecole zuccherini si associano a formare molecole circolari chiuse: costituiranno l'elemento strutturale del DNA e RNA, mentre gli si ritrovano nelle strutture polisaccaridiche, glucosio o fruttosio. Sono generalmente pentosi esosi.

Si legano attraverso legami glicosidici, coinvolge zuccheri diversi dal glucosio. Legami semplici che congiungono le molecole. Ne esistono di diversi:

• Alfa glucosidasi se le molecole sono orientate allo stesso modo.
• Beta glicosidico se le molecole sono di senso invertito, rovesciate.

Alcuni polisaccaridi importanti sono l’amido, sostanza di riserva, costituito da molecole di glucosio legato da legami glucosidici, cellulosa.

Lipidi

Lipidi: Molecole costituite da acidi grassi uniti in catene idrocarburiche, alternanza di carbonio e idrogeno, che presentano all'estremità un gruppo carbossilico, gruppo acido. La lunghezza può variare, 16, 18 atomi di carbonio. Può variare anche il grado di insaturazione, se presenta legami doppi:

Gli acidi grassi si dicono saturi se non sono presenti doppi legami. Questi acidi grassi si legano al glicerolo tramite legame estere, lega fino a tre acidi grassi, formando il trigliceride:

• Acidi grassi costituiscono la componente idrofobica.
• Il glicerolo costituisce la parte idrofila e rende la molecola anfipatica, coda apolare e testa polare.

Queste strutture lipidiche si modificano nella cellula: come i fosfolipidi, nella membrana citoplasmatica, o il mono galattosio.

Acidi nucleici e nucleotidi

Acidi nucleici e nucleotidi: I nucleotidi sono unità strutturali monomerici basali della catena DNA ed RNA. Sono composti da basi azotate.

5 DNA trascrizione mRNA traduzione proteine → → → →.

6 Fonte di energia e è tuttora base della cellula.

7 Il legame glucosidico coinvolge il glucosio.

8 Il glicerolo lega due molecole di acidi grassi e in terza posizione si lega un fosfato e un etanolamina.

• Purine adenina e guanina presenti nel DNA ed RNA.
• Pirimidine citosina, timina e uracile.

Queste si legano ad un pentoso, ribosio o desossiribosio, e ad un gruppo fosfato. Uno dei nucleosidi più importanti è l’adenina, la quale andrà a formare un nucleotide:

• Adenosin monofosfato con l’aggiunta di un gruppo fosfato.
• Adenosin difosfato con l'aggiunta di due gruppi fosfato.
• Adenosin trifosfato o ATP con l'aggiunta di tre gruppi fosfato.

I legami che si determinano associando il secondo e il terzo fosfato sono legami fosfoanidridici ad alta energia.

Amminoacidi

Amminoacidi: Sono le subunità monomeriche delle proteine. Sono costituiti da una parte centrale carboniosa a cui si associa un gruppo carbossilico e un gruppo amminico. In corrispondenza del sostituente R la parte varia. Questa variazione del gruppo caratterizza i diversi amminoacidi.

A seconda del tipo di sostituente avremo:

• Amminoacidi acidi.
• Basici.
• Non polari, idrofobici.
• Non ionizzabili polari.

Alcuni aminoacidi sono definiti essenziali, 8 nel nostro caso, ovvero che non possono essere prodotti dal nostro corpo e vanno quindi assunti attraverso la dieta. Sono la base della struttura delle proteine tenuti insieme da legami covalenti di tipo peptidico che permettono di creare strutture lineari.

Parliamo infatti di struttura primaria di una proteina quando la struttura è lineare.

• Secondaria quando la struttura lineare assume una conformazione tridimensionale data da legami idrogeno che creano dei ponti tra H di una molecola e O di un altra.
  • Alpha elica quando la struttura assomiglia ad una molla ed è molto flessibile.
  • Beta foglietto quando la struttura è a strati ed è più rigida.
• Terziaria quando la struttura tende a ripiegarsi su se stessa, folding, portando a una conformazione tridimensionale.
• Quaternaria quando due o più subunità, polipeptidi, formano una struttura più complesse tramite legame idrogeno.

Denaturazione

Denaturazione: le proteine strutturali se mantengono una loro struttura mantengono anche la loro funzione. La denaturazione: perdita della struttura terziaria che si traduce nella perdita di funzione. Tale processo può avvenire per:

• Fattori chimici, utilizzo di urea. Una volta rimosso l'elemento causa di denaturazione la proteina riassume la sua tridimensionalità, reversibile.
• Fattori fisici, inattivazione termica, nella maggior parte dei casi una volta rimesso in condizioni standard la proteina non è più in grado di riattivarsi, irreversibile.

Cellula procariotica

Assente il nucleo nella cellula procariotica. È visibile il cromosoma, singolo e circolare, addensato al centro a formare una zona non compartimentata detta nucleoide. Questo cromosoma presenta solo zone codificanti, esoni. La struttura circolare può creare problemi di spazio.

Assenza di organelli se non per i ribosomi, con dimensione 70s formato da subunità 30s e 50s; il macchinario biochimico sfrutta la superficie cellulare. Presenti i plasmidi sequenze nucleotidiche non cromosomali, senza informazioni vitali, contenenti informazioni che la cellula acquisisce durante il corso della sua vita. Presente una membrana citoplasmatica e una parete cellulare.

Il mesosoma è un invaginazione della membrana citoplasmatica causato da alcune circostanze particolari, quali divisione cellulare, o per aumentare la propria superficie interna. I procarioti sono molto diversificati.

Cellula eucariotica

Nucleo delimitato da membrana, contenente più cromosomi con struttura lineare ed accoppiati. Il cromosoma è formato da introni, zone senza espressione genica, non codificanti, ed esoni, parte codificante. Sono presenti tanti organelli (...). Presente delle proteine dette istoni che legandosi al cromosoma permettono di assumere una conformazione particolare. Presenti i plasmidi.

9 Costituiscono una riserva di energia che è utilizzata quando viene rotto.

10 Fonte di azoto più importante nella cellula.

11 Escherichia coli è in grado di sintetizzare tutti gli amminoacidi.

12 Coefficiente di sedimentazione Svedberg.

Classificazione

Nel tempo si sono susseguite due metodologie di classificazione:

• Schema a cinque regni, monera, protista, fungi, animalia e plantae, o classificazione di Whittaker, che divide gli organismi secondo aspetti morfologici e funzionali, tipo di cellula, livello di organizzazioni, tipo di riproduzione.
• Schema a tre regni, bacteria, archaea e eukarya, basata sul confronto dell’RNA ribosomiale. Più complessa rispetto alla prima.

Dominio dei batteri

Dominio dei batteri: Organismi procarioti unicellulari ampiamente eterogenei, le cui dimensioni variano da 0,2-2 µm.

• Cocci: forma tonda dovuta alla mancanza di determinate proteine. Possono aggregarsi a formare:
  • Diplococchi, come lo pneumococco.
  • Streptococci, a catenella.
  • Staphylococci, a grappolo.
  • A sarcina, 4 cellule.
• Bacilli:
  • Strepto, a catenella.
  • Forme differenziate, clostridium tetani.
  • ...
• Spirochetes: forma spiralata.

Altre forme:

• A vibrio, virgola allungata.
• Forma anomala, dei prostecati.
• Forme pluricellulari, batteri miceliari.

Le cellule batteriche si dividono in due grossi gruppi:

• Positivi che hanno uno stato ispessito di peptidoglicano.
• Negativi il cui strato di peptidoglicano è limitato. Strato polisaccaridico.

Le cellule batteriche sono altamente diversificate: cianobatteri, 7 sono grandi, seguono i bacillus, 4 micrometri, e forme più piccole come escherichia coli, streptococcus, haemophilus...

Gram positivi costituiti al 90% da peptidoglicano mentre i gram neg al 10%. Il peptidoglicano fa da schermo per cui quando lavo con etano. Lo strato esterno dei gram negativi è lipopolisaccaride, in presenza di alcol questo strato viene eliminato e il cristal violetto fuoriesce dalla cellula.

Comprende il phylum dei proteobatteri, molto numeroso, i batteri gram positivi, salmonelle e e.coli, streptococchi, cianobatteri; esistono vari altri gruppi meno numerosi.

Dominio degli eucarioti

Dominio degli eucarioti: I phyla sono differenziati lungo ramificazione, nella quale più ci si allontana dall’origine più si incontrano organismi più evoluti. I diplomandi e tricomonadi non contengano i mitocondri. Gli eucarioti hanno acquisito le capacità conferite dai batteri con i quali erano in simbiosi. Nel caso dei tricomonadi e diplomonadi c’è stata un assenza della endosimbiosi:

• Funghi: organismi eucariotici che possono essere unicellulari, forme miceliari, o pluricellulari, funghi filamentosi. Possono differenziarsi tramite ciclo sessuato o asessuato e dare vita a corpi fruttiferi che daranno vita a gameti, spore.
• Virus: struttura particolare che siamo riusciti a visualizzare solo recentemente con la nascita dei microscopi elettronici. Possono essere di diverso tipo, batterico, animale...
• Alghe: possono avere struttura pluricellulare.
• Protozoi.
• Licheni: simbiosi tra alghe e funghi che permette a tali organismi di sopravvivere in situazioni particolari.

Dominio degli archaea

Dominio degli Archaea: presenta due tronchi numerosi, all'interno delle quali troviamo gruppi funzionali:

• Metanogeni, alofili e acidofili estremi.
• Associati ad ambienti anaerobici.

13 Queste sequenze sono particolarmente conservate nei microorganismi, sono cioè meno soggette a mutazioni ambientali. Attraverso la PCR si amplificano le sequenze che diversificano i vari organismi. Di queste sono poi osservate le basi azotate e confrontate con le banche dati.

14 Colera.

15 Muffe.

Microscopia

Microscopio dal greco micron e skopein è uno strumento che consente di risolvere e ingrandire oggetti di piccole dimensioni.

Potere di risoluzione: P.R, potere risolutivo è la distanza minima alla quale si devono trovare due punti affinché possano essere osservate come cellule distinte. Più il dispositivo è in grado di dare una risoluzione più questa distanza si può ridurre. Più è piccolo P.R. e maggiore è la capacità di osservazione 0,61λ/ n senα.

• λ-lunghezza d’onda luce incidente:
  • 0,55 µm nel visibile.
  • 0,25 µm nell’ultravioletto.
  • 0,055 Å nella microscopia elettronica.
• n-indice di rifrazione del mezzo interposto fra oggetto e obiettivo:
  • 1,0 aria.
  • 1,52 vetro e olio di legno di cedro.
• α-semiangolo formato del cono di luce emesso dall'oggetto, dipende dal mezzo interposto e dalla distanza di lavoro dell'obiettivo.

Il microscopio semplice ha una sola lente, mentre quello composto con più sistemi di lenti.

L'esame al microscopio serve a evidenziare forma, dimensione, mobilità, strutture interne….

Ciò che osserviamo al microscopio prende il nome di preparato il quale può essere di due tipi:

• A fresco, permettono di osservare le cellule secondo la loro forma e dimensioni senza che esse siano state osservate da interventi tecnici.
  • Schiacciato si mette una goccia del preparato in una goccia d’acqua su un vetrino portaoggetti e poi viene schiacciato con un vetrino coprioggetti.
  • A goccia pendente nel quale il preparato viene messo sul vetrino copri oggetti, su una goccia d’acqua, viene messo degli elementi adesivi, olio di legno di cedro, e rovesciando il vetrino portaoggetti lo p.