Microbiologia

Virus

Dal latino – veleno. Questi patogeni sono pericoli una volta che arrivano all’uomo – vuol dire che vi è stato adattamento. Essi hanno necessità di duplicarsi all’interno di un ospite – per creare danno e morte, quindi non trasmettersi, o per creare danno leggero e quindi rendere possibile trasmissione. Quindi un virus si può combattere se ospite è solo uomo, se portatori per poco, se vaccino efficace. Nel 1901 si scopre primo virus su uomo – quello di febbre gialla.

Cos'è

Parassita incapace di replicarsi al di fuori della cellula – che sia batterica o animale. Essi o derivano da prima delle cellule, o hanno co-sviluppo indipendente a cellule, o nascono dopo.

Caratteristiche

Non hanno struttura definita, possono integrare DNA, hanno dimensioni modeste (15-400 nm), ampio spettro, struttura semplice, tropismo (specifici), parassiti obbligati. Essi non possono produrre E o fare sintesi proteica – non crescono e non si dividono, si riformano da componenti preformate, sono inerti fuori dalla cellula, hanno solo un acido nucleico (o DNA o RNA).

Classificazione (Baltimore)

In base a struttura (capside, involucro lipidico) e a acido nucleico.

Struttura del virione

Genoma di acido nucleico con intorno capside, alcuni involucro lipidico aggiuntivo (envelope). Film lo rende più labile. Ad avere envelope sono i nasogromiali, in saliva, o quelli del sangue. A non averlo sono gli oro-fecali.

Capside

Simmetria icosaedrica – struttura salda similsferica – da 60 a 180 subunità – Herpes, Papilloma virus (altri enterovirus).

Simmetria elicoidale – interazione capside acido nucleico da elica flessibile – Coronavirus, Rhabdovirus etc.

Simmetria complessa – es. poxvirus, batteriofago T (testa icosaedrica, elicoidale terminale).

Genoma

DNA può essere a doppio o singolo filamento, lineare o circolare. RNA può essere a singolo, a doppio o a doppio incompleto (epatite B) filamento. A DNA sono meno, sono più adattati – vanno a infettare nuclei sia per trascrizione sia per traduzione. A RNA sono il 70% dei virus – acido nucleico lineare, solamente singolo (Reovirus doppio, Orthomyxovirus segmentato) – replicazione e traduzione in citoplasma. Classifica di Baltimore è secondo acido nucleico – per DNA 2 classi, per RNA molte.

La classificazione vi è pure in base al senso dell’RNA – i + sono direttamente trascritti e tradotti (come mRNA); i – prima ha retrotrascrizione da enzima RNApolimerasi RNA-dipendente (no proofreanding, tante mutazioni).

Criteri

• Ospiti – batteri, vegetali, animali, artropodi, vertebrati
• Organizzazione A. N. – DNA, RNA, singolo, doppio, segmentato, non
• 6 ordini, 87 famiglie, 19 sottofamiglie, 2285 specie
• RNA + come centrale – poi 7 classi

Ciclo replicativo

Cellule sono o suscettibili, con recettori, o permissive. Per infettare: trovare cellula, attaccarsi – adsorbimento, entrare – penetrazione, liberare genoma, trascrivere e tradurre proteine – replicazione – se non prodotte tutte le proteine allora infezione abortiva, assemblare genoma e proteine – assemblaggio – se questo avviene infezione è detta produttiva, uscire.

Per adsorbimento virus usa antirecettore per legare recettore (es. emoagglutina a gp120 per HIV). Penetrazione può avvenire per fusione se film idrolipidico se no viropepsi, virione in vescicola. Se virus nudi vescicola si fonde con endosoma, all’interno del quale inizia la degradazione del capside. Per la replicazione del DNA vedo replicazione normale, per RNA vie diverse. DNA vede prima DNApolimerasi, poi RNApolimerasi per produzione di mRNA – con fattori promoter ed enancher – mRNA creato ha poli-A in 3’ e cap metilato in 5’ (simulano cellula normale). RNA+ hanno unico gene per poliproteina poi tagliata. RNA replica in citoplasma, con RNApolimerasi replicasi e trascrittasi – polimerasi attivata quando liberato capside all’ingresso. Per assemblaggio dipende da capside iniziale – elicoidale si forma con l’ingresso dell’acido nucleico mentre icosaedrico si forma prima (cristallizzazione). Uscita avverrà invece con gemmazione se con envelope, lasciando cellula con cicatrici, o con lisi se naked. Neurominidasi favorisce rilascio. Per nascondersi usano poi proteine, canali, sincizi etc.

Infezioni e tumori

Virus oncogeni – tra i più comuni Papilloma Virus, Epstein-Barr, Herpes tipo 8. Nel 2018, 570 mila casi di tumore alla cervice dove causa è papilloma. Induzione del tumore → Induzione diretta: virus immortalizzano le cellule o entrando nel DNA danno mutazioni, bloccano apoptosi – papilloma, Epstein-Barr, Herpes 8 e HTVL-1 – danno proteine oncogeniche o integrano DNA (polymavirus).

Retrovirus endogeni – frammenti virali nel nostro genoma, che a seconda della posizione attivano geni tumorali o meno → Induzione indiretta: infiammazione cronica degenerata – HIV, Epatite B/C, Helicobacter pylori, parassiti. Alcuni papilloma sono cutanei – no danni gravi. Alcuni virus come herpes danno instabilità cromosomica – danni gravi.

Identificare virus tumorali

Dare infezione latente, integrarsi al genoma ospite, immortalizzare cellula. Alcuni virus sono la causa del tumore e altri sono un fattore di rischio per svilupparlo. Nel 2018, 2,2 milioni di casi di cancro da agenti infettivi – 13% - dati ASIR – maggior parte basso reddito.

Papilloma virus

Virus tumorogenici, immortalizzano cellule, ciclo vitale in epitelio. DNA è circolare a doppia elica – genoma piccolo – con regione LCR in 3’ per replicazione, regione Early con proteine funzionali (E1, E2, E4, E5, E6 e E7) e una regione Late, con proteine strutturali. Capside – 72 capsomeri suddivisi in due proteine – maggiore è esamero L1, minore è pentamero L2 – 60 L1, 12 L2.

Classificazione

Si basa sull’analisi della sequenza ORF di L1. 120 specie.

• Genere alfa – mucose – con antigeni a rischio oncogeno. Alfapapillomavirus per mucosa orale o anogenitale – parto e trasmissione sessuale (50% donne da esordio sessuale) in lesioni cutanee. Regolano presenza tessuto maligno. Codificano per proteina E5 in 3’. 40 genotipi.
• Betapapillomavirus – verruche, carcinomi cutanei, cellule squamose. Epidermodisplasia verruciforme.

Infezione

Dipende da equilibrio uomo agente – può regredire, persistere o progredire (80% transitorie). DNA del papillomavirus nel 99,7% dei carcinomi cervicali (primo tumore associato a infezione) – causa necessaria. Colpisce maschi e femmine – contatti cutanei, mucosi o indiretti. Non genitale – bolle cutanee, verruche e cancro alla pelle. Genitale – verruche, neoplasie, cancro a vulva, ano, cervice, pene etc. Malattie associate – anche carcinomi orali.

Meccanismo

Deve raggiungere lo strato basale degli epiteli – sfrutta microlesioni, usa endocitosi, in cellula interagisce con il recettore integrina α2β4 attraverso proteina L1 – poi replica in forma episomale fino 50-100 coppie – tradotti primi geni non strutturali – geni oncogeni E6 e E7 e i geni E1 e E2 – info per attivare il sistema virale nel sistema replicativo della cellula. Ho poi differenzazione epiteliale – figlie con stesso corredo virale – strato spinoso. A strato granulare replicazione aumenta – formazione episomiali e geni Early. Dopo granulare inizia produzione di proteine dei capsomeri e l'esfoliazione con propagazione del virus. Epitelio si sfoglia – progenie virale.

Proteine virali

• E1 – replicazione episomiale, con elicasi
• E2 – trascrizione promoter E6, attivazione E1, trascrive E2, inibisce E6 ed E7
• E4 – in fasi tardive, per proliferazione – lega citoscheletro e deforma (coilocitosi)
• E5 – blocca esposizione dei complessi d’istocompatibilità – evita risposta cellulare T mediata, inibisce apoptosi, altera segnali Growth Factor (epidermal e platelet-derivered)
• E6 – si lega a p53, interferisce con riparazione del DNA e innesco dell’apoptosi
• E7 – si lega a retinoblastoma, blocca ciclo cellulare

Spettro clinico

Il tipo asintomatico è diviso in 3 tipi: benigna, premaligna e maligna. Non-genitali – sintomatici.

Storia del cancro cervicale

L’infezione transiente può regredire o diventare una infezione persistente. I fattori di rischio collegati a questa infezione sono, per esempio, l’igiene, l’utilizzo di preservativi, comportamenti sessuali. La circoncisione è vista essere l’unico fattore protettivo. Nella cervice infetta l’infezione può diventare visibile – infezioni anche multiple. Non ho ancora lesioni permanenti. Se infezione progredisce ho situazione prima precancerosa e poi cancerosa. Nelle lesioni precancerose, abbiamo delle ferite nella zona della cervice nel punto di vista tissutale. Cellule da normali a maligne – integrazione gene 16 e 18 – con sovraespressione di E6 ed E7 – vedo taglio di E2, quindi incapace di regolare E6 ed E7 – attivazione oncogeni – proliferazione incontrollata. Solo E6 ed E7 espresse in cancro cervicale. E7 inibisce proteina RB – inibisce riparazione del DNA. E6 inibisce la proteina p53 – inibisce apoptosi – crescita incontrollata.

Infezione da HPV e malattia

Associata a 99% dei tumori cervicali. Con HPV 16 e 18 maggiormente. Oltre per il tumore cervicale, è causa anche dei tumori anogenitali, dell’orofaringe, della cute. Es. tumore del pene, vulva, vagina, ano, orofaringe, collo, testa – 5% dei cancri globali. Testa e collo correlato pure a fumo e bevande calde.

Diagnostica

• Esame citologico – Pap-test
• Esame colposcopico – biopsia
• Esame istologico
• Per zona ano-genitale tampone; per zona oro-faringea tampone; per biopsie tessuti paraffinati
• Metodi diretti per rilevare il virus – test di rischio oncogeno – identifica soggetti a rischio
• Dopo posso classificare le lesioni – displasia lieve (CIN I - SIL basso), displasia (CIN II), displasia severa (CIN III) (SIL alti)

Aggravanti

Fumo, contraccettivi orali, HIV – cofattori per cancerosi.

Prevenzione

Educazione della salute, vaccini preventivi. Per vaccini – particelle virus-like specie-specifica, polivalenti, iniettati prima dell’inizio sessuale (inefficaci post contatto). Vaccino 9-valente anche per gli uomini, dai 9 anni (maschi poi fino 15, donne fino 26). Primo vaccino espressamente indicato per la prevenzione del cancro – adolescenti, donne di 25 anni, soggetti fino ai 24 anni se richiesta copertura maggiore. Lo screening dà invece prevenzione secondaria – pap-test – se esame negativo torno dopo 3 anni se no colposcopia, se meno di CIN II aspetto se no tratto.

Herpesvirus

Da herpein, insinuarsi – uno dei principali virus umani, dopo influenza e raffreddore. L’Herpes Simplex 1 – labiale – mucoso. Herpesvirus sono ubiquitari. L’acquisire questo virus una volta porta a infezione a vita – latentizzanti dopo infezione primaria. 100 ceppi, 8 umani. Virus sono endocellulari obbligati specie-specifici, modello chiave-serratura. Infezione primaria asintomatica, poi ricorrente da patologie.

Caratteristiche

DNA a doppio filamento, 150-250 nm di diametro, simmetria icosaedrica del capside, con envelope (con sopraglicoproteine spike), tra capside e envelope ho tegumento (8 polipeptidi usate per sfruttare biosistema cellulare). Latenza qui è vera, non clinica, da latenti non si replicano, sono silenti e non rilevabili, si trovano in cellule diverse da quelle replicative, con genoma circolare o integrato a cellulare. Questi virus possono essere attivati da stimoli, che danno trascrizione per proteine virali – replicazione recidiva. Altri virus latenti sono – Polyomavirus; i Papillomavirus; Adenovirus; epatite B – hanno in comune intermedi di DNA. Gli herpesvirus umani sono classificati in base alla lunghezza del ciclo di replicazione, cellule su cui latenza, genoma.

3 famiglie

• Alphaherpesvirus – ciclo litico breve, in cellule neuronali – simplex 1 2 (labiale e genitale) e varicella zoster
• Betaherpesvirus – ciclo lungo, in sistema immunitario, linfociti T, e in rene – Citomegalovirus, herpes 6 7
• Gammaherpesvirus – ciclo variabile, in tessuto linfatico, linfociti B – Epstein Barr (mononucleosi), sarcoma di Kaposi

Struttura del genoma

Lineare a doppio filamento, con dimensioni e orientamento variabili. Con sequenze ripetute, dirette o invertite. Ripetute possono poi essere interne o esterne.

• Herpes Simplex ha sequenza unica codificante al centro e poi sequenze ripetute ai lati della lunga e della corta.
• Varicella-Zoster manca invece di queste sequenze ripetute.
• Epstein-Barr è più complicato: ha delle sequenze ripetute che si intercalano.
• Citomegalovirus, avente il genoma più lungo, ha sequenze ripetute, ma manca di quella finale.
• HHV6 e HHV7 sono più semplici e hanno un genoma di dimensioni più ridotte.

Ciclo replicativo

Adsorbimento – riconosciuto target con recettore glicoproteico, in particolare D e C. Fusione e penetrazione – entrata virus con fusione tra envelope e membrana o con endocitosi. Replicazione – nucleocapside passa dai pori nucleari, DNA al nucleo, capsidazione e replicazione – proteina alpha-TIF del tegumento promuove trascrizione geni funzionali, le proteine vhs nel citosol bloccano sintesi proteica, a favorire virus.

Focus

• Penetrazione – per Herpes Simplex glicoproteina D fusogena con attacco a entry mediator; il complesso gE/gI e la gM interagiscono con i recettori delle giunzioni cellulari, facilitano la diffusione del virus cellula/cellula.
• Per Epstein-Barr glicoproteina 42 che riconosce la HLA-II sulle cellule B, mentre la glicoproteina Hr riconosce le integrine per le cellule epiteliali.
• Per HHV8 vedo le glicoproteine gB/H/L legare le integrine. Processo sempre lo stesso ma con recettore e anti-recettori specifici.

Prima si pensava tutti i virus entrassero per fusione, con microscopia è stata dimostrata presenza virale in vescicole. Replicazione – capside a poro, genoma in nucleo, DNA virale circolare, replicazione di DNA-polimerasi DNA virale dipendente – bersaglio terapeutico. DNA replica con rolling-circle – replicazione unidirezionale a dare tante copie in poco – meccanismo efficace.

Altra caratteristica è alta regolazione – trascrizione, traduzione e produzione di proteine – non ho trascrizione di tutto RNA e poi produzione contestuale ma ho cascata di produzione di mRNA. Prima classe di mRNA sono gli alpha genes, geni precocissimi, a dare proteine regolatrici e fattori di trascrizione – a dare geni beta, geni precoci, a dare timidinochinasi e DNA polimerasi – a dare geni gamma, geni tardivi, a codificare proteine del capside e glicoproteine dell’envelope. Avendo cascata regolazione facile – latenza diversa da virale.

Acquisizione envelope e uscita – proteine ora assemblate, ho tagli dopo ingresso in nucleocapside, a dare una molecola a capside, con fuoriuscita attraverso vescicole del golgi ed esocitosi.

Latenza

Es. Una volta terminata l’infezione primaria sintomatica o asintomatica, gli Alphaherpesvirus risalgono attraverso gli assoni e arrivano al ganglio, mentre gli altri virus andranno a localizzarsi nelle altre cellule bersaglio. Per mantenere latenza serve fuggire dal sistema immunitario – shot down della trascrizione, attivi solo LAT’s per latenza, con spegnimento degli ICP0, necessari per infezioni produttive, in quanto scatenatori di cascate attivatorie. È stato ipotizzato un meccanismo antisenso per l'espressione di LAT/ICP0, poiché il terminale dell'mRNA LAT si sovrappone al terminale 3' di ICP0.

Alcuni herpesvirus ubiquitari – sieroprevalenza del 90% (es. varicella) ma asintomaticità rende soggetti inconsapevoli. Con sieroprevalenza ho facilmente attivazione in seguito a stimoli – es. herpes labiale con raggi UV o stress. HVV2 ed HHV8 meno presenti. Pazienti con AIDS o trapiantati hanno riattivazione più probabile.

Alphaherpesvirus

Herpes simplex 1 e 2, varicella zoster. Ciclo replicativo breve, effetto citopatico marcato, tropismo tissutale (gangli nervosi – rispettivamente – trigemino, sacrali, dorsali). HSV1 e HSV2 – omologia del genoma pari al 50%, antigeni simili, tropismo tissutale per mucose – ma HSV1 trasmesso con gocce di saliva, HSV2 con rapporti sessuali (aree mucose colpite diverse – herpes orale vs genitale).

Patogenesi

Prima infettano mucoepiteliali, entrano da cute lesa, poi con trasporto assonale retrogrado vanno a trigemino o sacrali, per poi essere resi silenti da LATs, episomi, fino a quando stimolo trascrive IPC0, che attiva cascata d’attivazione (spesso di nuovo in assoni). Essudati con vescicole ricche di particelle virali – contatto da infezione (pure per varicella). Se sistema immunitario compromesso ho viremia, con danni a cellule gravi.

Patologie associate

• HSV1 – herpes labiale (fase prodomica con formicolio, eritemica con arrossamento, vescicole, ulcere da rottura, crosta), stomatite, faringite erpetica, eczema erpetico, patereccio erpetico, gengivostomatite primaria, herpes gladiatorum, encefalite erpetica, herpes neonatale, cheratocongiuntivite erpetica.
• HSV2 – herpes genitale, con complicanze in neonati (meningiti, polmoniti, encefaliti). Meningite da HSV2 o da varicella è causata da contagi ematogeni – meningite virale. Trasmissione di HSV2 anche in asintomatologia – scambi di fluidi organici – in utero, parto, post natale.

In utero – test di TORCH - TOxoplasma gondi, il virus della Rosolia, il Citomegalovirus e appunto gli Herpesvirus simplex.

Diagnosi

Sierologia da presenza o meno – ma non da info su stato (attivo o latente). Va cercato il DNA e vanno svolte indagini strumentali, es. TAC, per eventuali danni. A livello citologico ho diagnosi rapide attraverso ricerca di anticorpi e antigeni virali.