Microbiologia generale

Microbiologia generale

Prof. Federica Briani

Email: federica.briani@unimi.it

Esercitazioni

• 1 pomeriggio in presenza nel periodo 10-13 e 17-20 maggio (turni da 16 studenti)
• 3 pomeriggi da remoto in modalità sincrona 24-25-26 maggio

* Laboratorio obbligatorio per sostenere l'esame

* Preiscrizione via SIFA entro 21 marzo

* 28 marzo-18 aprile: iscrizione ai turni

* 14:30-18:30, via Celoria 26, Laboratorio 14 (seminterrato corpo D)

Esame

• Forse appello straordinario a Novembre per i laureandi di Dicembre
• Esame scritto in presenza su lezioni e laboratorio:
  • 30 domande a risposta multipla (24 punti)
  • Disegno e analisi di una curva di crescita (4 punti)
  • Riconoscimento di 4-5 immagini di molecole/strutture/processi (2 punti)
  • 1 domanda sulle esercitazioni (1 punto)

→ Superamento rispondendo a 20 domande a risposta multipla

→ Chi consegue un punteggio uguale o superiore a 26 può sostenere un esame integrativo (+/- 3 punti)

> Se non è possibile: esame orale

Testi

Dehò, Galli - Biologia dei Microrganismi

La Microbiologia

Organismi microscopici unicellulari

• Procarioti → 2 domini (1990):
  • Archaea
  • Bacteria
• Eucarioti (Eukarya)
• Altri organismi → Virus

Batteri e Archea

> Più piccoli degli eucarioti: ~2µm

• Organizzazione cellulare:
  • NO nucleo → nucleoide (cromosoma batterico)
  • NO organelli → ribosomi per sintesi proteica
  • Parete batterica
  • Appendici proteiche
  • Membrana cellulare → diversa in Archea
  • Diversi apparati per replicazione, trascrizione, traduzione del DNA

Batteri

• Gruppo più numeroso
• Possono essere patogeni → poche specie
• Occupano quasi tutti gli ambienti
• Alcuni fanno fotosintesi

Archaea

• Ambienti estremi
• Producono metano
• Tutte le forme di vita derivano da LUCA (= Last Universal Common Ancestor)
• Ramo dei batteri si stacca presto
• Archaea e Eukarya sono più imparentati → espressione genica più simile
• Esistono molti batteri ancora non categorizzati
• Sono stati i primi e unici esseri viventi sulla Terra
• Trasformazione atmosfera da riducente a ossidante grazie a fotosintesi ossigenica (alghe e cianobatteri)
• Alcuni batteri sono in grado di fissare l'azoto → vita libera/simbiosi con piante (Rhizobium)
• Batteri decompositori → decompongono sostanza organica fino a CO₂ → permettono riciclo
• Simbiosi con animali → microbiota = insieme di batteri simbionti che abitano in un organismo
  • Esempi: digestione cellulosa nei ruminanti, bioluminescenza in organismi marini, nel colon: 10¹¹ batteri/g
• Microbioma = insieme ai geni batterici presenti in un organismo
• Utilizzati nell'industria: alimentare, carburante, vaccini, antibiotici, farmaci

Storia della microbiologia

• Nasce con invenzione del microscopio ottico: 1600 - 1700, Antony van Leeuwenhoek → scopre "animaletti" invisibili ad occhio nudo
• Esclusione della teoria della generazione spontanea:
  • Francesco Redi, 1600 → larve della carne in putrefazione NON si generano se la carne viene tenuta lontano dagli insetti
  • Lazzaro Spallanzani, 1700 → microrganismi NON si generano se il brodo scaldato viene chiuso
  • Louis Pasteur, 1800 → si accorge che i microrganismi che producevano vino erano diversi da quelli che trasformavano vino in aceto
• Robert Koch:
  • Scopre batteri del carbonchio e della tubercolosi
  • Postulati di Koch (1881):
    • Agente causale presente in tutti i malati e assente negli individui sani
    • Omogeneità dell'agente causale isolato dall'individuo affetto
    • Inoculazione dell'agente causale sempre seguito da comparsa della malattia
    • Reisolamento dell'agente causale dall'organismo infettato sperimentalmente
• Martinus Beijerinck e Sergej Vinogradskij → nascita microbiologia ambientale = come i microrganismi interagiscono con l’ambiente

Cellula procariote

• Piccole dimensioni: 1-5µm (eucarioti: 10-100µm)
  • Alcuni più piccoli: 0.2µm es: micoplasmi (parassiti obbligati)
  • Alcuni più grandi: quasi 1mm → visibili a occhio nudo es: Thiomargarita namibiensis, Epulopiscium fishelsoni (intestino pesce chirurgo)
  • Piccole dimensioni permettono scambi rapidi: alto rapporto S/V → crescita rapida
• Morfologia:
  • NO valore tassonomico (eccezione: Spirochete → appartengono tutte allo stesso phylum)
  • Bastoncelli o bacilli
  • Cocchi = forma sferica
  • Spirali:
    • Vibrioni → 1 punto di torsione
    • Spirilli → più punti di torsione
    • Spirochete → filamenti molto lunghi con diversi punti di torsione
  • Prostecati → presenza di prosteche = peduncoli di adesione a substrato solido
  • Filamenti → lineari → possono organizzarsi in ife
  • Batteri pleomorfi = possono cambiare morfologia
• Isolati o associati:
  • Spirali si separano sempre dopo divisione
  • Cocchi e bacilli possono rimanere uniti:
    • Diplococco / diplobacillo = coppia
    • Streptococco / streptobacillo = catenella
    • Sarcina = associazione a cubo di 8 cellule * solo cocchi
    • Stafilococco = associazione di più cocchi di forma glomerulare
  • Ife → spesso divise in segmenti multinucleati (più nucleoidi)

> Aggregati multicellulari → colonie (su terreno solido)

Miceli = strutture complesse formati da ife appartenenti agli Actinobacteria (ciclo cellulare complesso, importanti produttori di antibiotici)

• Ife crescono all'interno del terreno = micelio del substrato
• Quando finiscono i nutrienti → crescita sopra il terreno = micelio aereo
• Parte terminale delle ife aeree → differenziamento: conidi = compartimenti mononucleati che formano spore

Biofilm

Aggregazione multi specie in ambiente naturale che può coinvolgere anche eucarioti unicellulari

Le cellule crescono in una matrice prodotta da loro stesse che è molto difficile da trattare

Composizione chimica

Elementare del tutto simile agli eucarioti

Differenze rilevanti nelle macromolecole che compongono:

• Parete dei Bacteria
• Membrana degli Archaea

Studio composizione chimica

1. Allestimento coltura batterica:
   • Inoculo in 1L di terreno di coltura:
     • Acqua
     • Saluti: nutrienti, altro...
   • Incubazione a 37°C con aerazione
     • Attenzione a:
     • Luce
     • Ossigeno
     • Temperatura
     • pH
     • Altro...
2. Stabilire titolo = concentrazione batterica
   • Conta vitale = numero di colonie che si sviluppano una volta piastrati i batteri dopo diluizioni parziali * ogni colonia indica 1 cellula
     • Esempio: 100 colonie da 1 mL di diluizione x 10⁷ seminata: 10⁹ batteri/mL × 1000mL = 10¹² batteri
3. Raccolta cellule mediante centrifugazione
4. Pesatura del pellet → peso umido: ~ 1g
5. Essiccazione cellule → peso secco: ~ 0.2-0.3g
6. Analisi chimica elementare → stessi elementi del terreno di coltura:
   • Componenti macromolecole: C, N, O, H, P, S
   • Presenti in forma ionica: K, Na, Mg, Ca, Cl, Fe
   • Tracce di: Mn, Co, Zn, Cu, Mo, Se...
7. Macromolecole (96% peso secco):
   • Proteine → 55%; 2,5 milioni molecole/cellula; 2K tipi diversi
   • RNA → 20%; 260K molecole/cellula; 1K tipi diversi
   • Lipidi → 11%; 22 milioni molecole/cellula; 4 tipi diversi
   • Polisaccaridi → 7%; 5K molecole/cellula; 2 tipi diversi
   • DNA → 3%; 1-2 molecole/cellula; 1(+) tipi diversi
8. Monomeri, precursori, altre molecole organiche (3%)
9. Ioni inorganici (1%)

Cellule necessitano di

• Energia: secondo la fonte:
  • Fototrofi → luce
  • Chemio-inorganotrofi → composti inorganici
  • Chemio-organotrofi → composti organici
• Materia: secondo la fonte di C:
  • Eterotrofi → C organico
  • Autotrofi → CO₂
• Informazione

4 categorie nutrizionali principali

1. Fotoautotrofi → piante, alghe, cianobatteri, solfobatteri rossi e verdi
2. Fotoeterotrofi → alghe, batteri, fotosintetici rossi, alcuni archea
3. Chemioautotrofi (o litotrofi) → batteri e archei
4. Chemioeterotrofi → batteri, archei, funghi, animali

* Mixotrofi = organismi che possono alternare processi metabolici di classi diverse

Envelope

= Rivestimento delle cellule procarioti

1. Membrana citoplasmatica → struttura conservata
2. Parete cellulare → varie strutture
   • Gram-positivi
   • Gram-negativi
3. Capsula * NON essenziale

Membrana

Bacteria

• Simile a eucarioti
• Spessore: ~8nm
• Doppio strato fosfolipidico → diacil-glicerolo
  • D-glicerolo
  • 2 acidi grassi solitamente saturi (~16C)
    • Legame estere con glicerolo
    • Se doppi legami → molecola più instabile
  • P legato a C3
  • Residui associati a P:
    • Etanolammina → fosfatidil-etanolammina
    • Colina → fosfatidil-colina
    • Serina → fosfatidil-serina
  • Possono essere associati glicolipidi (rari)
• Proteine di membrana:
  • Integrali → α-eliche
  • Periferiche
  • Lipoproteine → lipide N-terminale che le ancora a membrana
  • Più proteine rispetto a eucarioti: ~ 70-75% del peso della membrana; 50% della superficie esterna
    • ~ 200 tipi diversi
• Fluidità:
  • Determinata da:
    • Acido grasso: lunghezza, ramificazioni, saturazione
    • R = residuo legato a P
    • Altri lipidi di membrana:
    • Opanoidi = danno rigidità a membrana
  • Strutturalmente simili a steroli (normalmente non presenti)
    • Micoplasmi = batteri parassiti obbligati che prendono steroli dalle cellule dell'ospite
    • Batteri metilotrofi sono in grado di produrre steroli
  • Influenzata da fattori ambientali es: temperatura
    • Batteri modificano composizione dei lipidi in funzione di questi fattori

Archaea

• Doppio strato fosfolipidico: → di-eteri
  • L-glicerolo
  • 2 molecole di fitanile = catene di isoprene
    • Legame etere con glicerolo
  • P legato a C1
• In alcuni casi: → tetra-eteri
  • 1 strato di bi-fitanile = molecola unica di lunghezza doppia rispetto a fitanile con 2 glicerolo alle estremità
  • Possono essere presenti molecole cicliche: crenarcheoli
  • Molto resistenti
  • Batteri che vivono in ambienti estremi es: ipertermofili
  • LUCA → membrane miste, racemiche
  • Archaea possono sintetizzare acidi grassi
  • Bacteria possono sintetizzare isoprene
• Evidenze sperimentali:
  • Liposomi con membrane miste sono stabili
  • E. coli ingegnerizzato produce membrane miste stabili
  • Probabilmente evoluzione proteine di membrana hanno portato alla diversificazione dei 2 tipi di membrana

Funzioni della membrana citoplasmatica

1. Interfaccia con ambiente esterno:
   • Isola la cellula
   • Controlla scambi
   • Percepisce segnali extracellulari e li trasmette all'interno
   • Secerne prodotti extra-citoplasmatici ed extracellulari
2. Sede di accumulo e trasformazione di energia:
   • Batteri che fanno fotosintesi o respirazione
   • Catena di trasporto degli e-: flavoproteine, proteine Fe-S, citocromi, chinoni (=trasportatori non proteici) → produzione ATP
3. Sede di biosintesi di:
   • Acidi grassi → rigenerazione membrana
   • Strutture extracellulari es: appendici

Agenti antimicrobici

• Saponi, detergenti
• Solventi organici
• Antibiotici (polieni) che legano steroli di membrana
  • Esempio: Anfotericina B: lega ergosterolo → fungicida
• Antibiotici (polimixine) che danneggiano il doppio strato lipidico
  • Esempi: Polimixina B: si inserisce con la coda idrofobica nella membrana destabilizzandola
  • Daptomicina: si inserisce con la coda idrofobica nella membrana e polimerizza formando canali
• Antibiotici o altri composti ionofori:
  • Trasportatori mobili di ioni
  • "Canali" es: Gramicidina: α-eliche che si associano a formare canali nella membrana
• Peptidi antimicrobici
  • 12-50 aa attivi nella risposta immunitaria innata che riconoscono membrane batteriche cariche negativamente

Trasporti attraverso membrana

Molecole trasportate

• Saluti e piccole molecole es: ioni, nutrienti, prodotti di scarto
• Macromolecole e grosse molecole es: proteine, DNA

Piccole molecole

• Direzionalità:
  • Secondo gradiente → trasporto passivo
  • Contro gradiente → trasporto attivo
• Diffusione semplice:
  • Gas
  • Molecole idrofobiche
  • H₂O
  • Molecole scarsamente polari
• Apparati specifici:
  • Molecole polari
  • Ioni
• Meccanismi di trasporto:
  • Diffusione:
    • Semplice = attraverso membrana
    • Facilitata = attraverso canali
  • Trasporto attivo:
    • Primario = uso diretto di energia chimica (ATP), elettrochimica, fotochimica
    • Secondario = uso di energia potenziale di un gradiente elettrochimico (simporto, antiporto, uniporto) o diffusione facilitata
    • Traslocazione = modificazione chimica del substrato trasportato
• Trasporto attivo secondario:
  • Dissipazione di un gradiente elettrochimico
  • H⁺ spostato secondo gradiente per spostare un'altra specie contro gradiente
• Trasportatori ABC:
  • Trasporto attivo primario
  • Spesso trasportano tossine all'esterno
  • Coinvolti nella resistenza agli antibiotici
  • 3 componenti:
  • Proteina extracellulare → lega sostanza da trasportare
  • Trasportatore attraverso membrana → canale
  • Proteina che idrolizza ATP → energizza il trasporto
• Sistema della fosfotrasferasi:
  • Traslocazione del glucosio e altri zuccheri
  • 5 enzimi:
    • Enzima I → defosforila PEP e passa P
    • HPr → passa P
    • Enzima II a → passa P
    • Enzima II b → passa P
    • Enzima II c → trasporta e fosforila Glu

Parete cellulare

• Tipica di batteri → target di antibiotici
• Diversa in diversi gruppi * mureina sempre presente
• Strutture più esterne NON essenziali:
  • Glicocalice = polisaccaridi che svolgono funzioni importanti es: virulenza, associazione di più cellule
    • Capsula → adeso alla superficie
    • Strato mucoso → più diffuso
    • Può essere presente solo in alcuni ceppi all'interno della stessa specie
  • Strato s = strato proteico con struttura para-cristallina
• 2 strutture di base:
  • Gram positivi → raggruppamento tassonomico
  • Gram negativi → NO valore tassonomico
  • Nome deriva dalla colorazione di Gram:
    1. Tutte le cellule colorate con il colorante di Gram → blu
    2. Trattamento con etanolo:
       • Cellule che rimangano colorate
       • Cellule che si decolorano
    3. Colorazione con safranina → cellule decolorate si colorano di rosa
    4. Cellule blu → batteri Gram +
    5. Cellule rosa → batteri Gram -

Gram -

• Sottile strato di mureina → nel periplasma
• Membrana esterna molto spessa → LPS (lipopolisaccaride)
• Didermi = doppia membrana
• Esempio: Escherichia coli

Gram +

• Singolo strato di mureina molto spesso
• Monodermi = 1 sola membrana
• NON tutti: alcuni presentano membrana esterna
• Esempio: Staphylococcus aureus
• Classificazione preferibile: monodermi – didermi

Mureina

= Peptidoglicano → singola molecola

• Forma sacculo → circonda totalmente la cellula
• Degradata da lisozima
• Funzioni:
  • Mantiene forma → protoplasti (= cellule senza parete) diventano sferici in soluzione isotonica
  • Protegge da lisi osmotica → cellule si rompono in soluzione ipotonica
• Filamenti glicanici paralleli tra loro:
  • N-acetil-glucosammina (NAG)
  • Acido N-acetil-muramico (NAM)
  • Uniti da legami peptidici
• Unità monomerica: glicano tetrapeptide
  • NAG + NAM uniti da legame β-1,4-glicosidico * sensibile a lisozima
  • Residuo di acido lattico di NAM lega tetrapeptide:
  • L-Alanina
  • Acido D-glutammico
  • Batteri Gram - → Acido meso-diamino-pimelico
  • Batteri Gram + → Lisina
  • D-alanina
• Legame peptidico:
  • Batteri Gram - : tra 3 e 4
  • Batteri Gram + : ponte interpeptidico di 5 Gly tra 3 e 4
• Presenza di D-aa → resistenza a proteasi

Batteri Gram +

Strato molto spesso di mureina (~ 50 nm):

• Fino a 40 strati di peptidoglicano
• 30-70% del peso secco della cellula
• Periplasma = spazio tra membrana e parete
• Altre molecole presenti in parete:
  • Acido teicoico = polimeri contenenti P che derivano da glicerolo/ribitolo → glicerol-fosfato/ribitol-fosfato
  • Acido lipoteicoico → attraversa tutta la parete e interagisce con membrana grazie a una parte lipidica → ancora parete a membrana
  • Acido teicuronico = polimeri di NAG e acido glucuronico che non contengono P
  • Proteine
  • Funzioni:
    • Rafforzano parete
    • Conferiscono proprietà chimico-fisiche particolari es: aumentano carica
    • Costituiscono antigeni di superficie