Microbiologia avanzata (esame a scelta di tipo D)

Virologia medica

Viroidi e prioni

Sono particelle infettanti più piccole dei virus. I viroidi, scoperti negli anni ‘70, causano malattie nelle piante e sono costituiti da RNA circolare di 200/400 basi che non codificano per proteine. I prioni sono molecole proteiche presenti sulle cellule nervose. La forma patogena induce la trasformazione delle proteine circostanti, portando proteine sane a diventare patogene, causando malattie come le encefalopatie spongiformi. In questo modo, un individuo sano si ammala a contatto con tessuto infetto. Negli anni ‘80 è comparsa l’encefalopatia bovina (morbo della mucca pazza) dovuta a prioni.

Virus

I virus furono scoperti cercando la causa della malattia del mosaico del tabacco, che bloccava la crescita della pianta. Il termine "virus" significa veleno. Negli anni ‘30, con il microscopio elettronico, si potevano finalmente vedere. Sono organismi al limite della vita e non sono classificati all’interno dei 5 regni (Batteri, Protisti, Piante, Funghi e Animali) perché necessitano di un altro organismo vivente per vivere.

Caratteristiche dei virus

• Sono parassiti intracellulari obbligati.
• Infettano altri tipi di cellule.
• Sono i microrganismi più abbondanti sulla terra.
• Visibili solo al microscopio elettronico (20nm-300nm).
• Puntano su impacchettamento e trasferimento, con tre capacità principali:
• Involucro protettivo.
• Codificare senza esaurire capacità codificante (economia genetica).
• Strategie per entrare ed uscire dalla cellula.

Sono costituiti da un core di acido nucleico (DNA* o RNA*) + capside e alcuni possiedono anche un envelope. Il DNA o RNA può essere a ds o ss, cioè ss = single strand oppure ds = double strand.

Esistono due tipi principali di virus:

• Nudi: capacità antirecettoria legata alle proteine del capside.
• Rivestiti: l’envelope si ottiene per gemmazione dalla cellula ospite ed è formato da proteine della membrana cellulare e da glicoproteine virus-specifiche (antirecettori) che servono per ancorare e mediare l’ingresso nella cellula.

La ristretta capacità codificante del genoma virale impone che il capside debba avere un limitato numero di proteine virus-specifiche; in alcuni casi vi è una sola proteina. Le forme che assume sono quindi limitate a due principali:

• Cubica-icosaedrica (tipica di virus a DNA)
• Elicoidale

Classificazione di Baltimore dei virus

La classificazione dei virus per gruppo (da I a VII) dipende da:

• DNA/RNA
• ss/sd
• Orientamento +/-

L’orientamento è + se la sua sequenza coincide con quella dell’mRNA impiegato per la sintesi proteica, ecc. I virus del VI e del VII gruppo sono RNA ss e sintetizzano mRNA mediante enzima trascrittasi inversa, un enzima DNA polimerasi (= assembla DNA) dipendente da RNA (= usa RNA come stampo).

La trascrittasi inversa fu scoperta da Temin e Baltimore (Nobel 1975).

• Gruppo I: DNA ds (es. adenovirus, Herpes virus, papilloma virus, poliomavirus)
• Gruppo II: DNA ss + (es. parvovirus canino)
• Gruppo III: RNA ds (es. rotavirus)
• Gruppo IV: RNA ss + (es. SARS-CoV-2)
• Gruppo V: RNA ss – (es. influenza, ebola)
• Gruppo VI: RNA ss + con trascrittasi inversa (es. HIV)
• Gruppo VII: DNA ds incompleto con trascrittasi inversa (es. epatite B)

Replicazione virale

Sensibile: cellula che possiede recettori che vengono riconosciuti da antirecettori virali.

Permissivo: cellula che offre al virus le condizioni per la replicazione.

Fasi del ciclo replicativo virale

Adsorbimento: interazione tra proteine presenti sulla superficie del virione (antirecettori) e molecole della superficie cellulare (recettori). Alcuni virus richiedono anche l’interazione con altre molecole secondarie oltre ai recettori, i corecettori. Gli antirecettori sono glicoproteine nei virus con envelope, mentre nei virus nudi sono proteine di capside. Dai recettori cellulari dipende il TROPISMO. Il sistema immunitario può riconoscerli e legarli, in modo che il virus non abbia più la chiave per entrare nella cellula.

L’adsorbimento è un processo che non richiede energia ed è indipendente dalla temperatura. È irreversibile per molti virus nudi poiché avvengono alterazioni strutturali che fanno perdere loro la capacità infettante (es. poliovirus perde proteina del capside che lo proteggeva da ribonucleasi e proteasi), mentre altri virus hanno la capacità di staccarsi dalla cellula (es. orthomixovirus e paramixovirus). Alcuni virus possono entrare nella cellula anche dopo essersi complessati con anticorpi virus-specifici presenti in quantità sub-neutralizzanti (es. West Nile virus, HIV, virus Dengue).

Penetrazione

I virus entrano per:

• Endocitosi (virus senza envelope ma con antirecettori): si forma un canale che permette al materiale genetico di entrare; un aiuto a questo processo sono i rafts lipidici.
• Fusione envelope con membrana cellulare: le glicoproteine si legano alla membrana e il capside con genoma entra nella cellula. Alcuni virus hanno proteine che favoriscono questo processo (es. HIV, Ebola, virus influenzali).

Scapsidazione

Fase attraverso la quale il genoma virale si separa dalle proteine che lo rivestono. Alcuni virus (es. poliovirus) entrano con solo il materiale genetico pronto alla replicazione, mentre molti altri devono liberarsi delle proteine che avvolgono il genoma e vanno quindi incontro a una fase di disassemblaggio tramite enzimi.

Quando si ha un genoma "pulito", quasi tutti i virus a RNA replicano a livello citoplasmatico, mentre quasi tutti quelli a DNA necessitano degli enzimi e dei fattori presenti nel nucleo e quindi si spostano in esso attraversando i pori nucleari.

Maturazione e liberazione

Avviene per gemmazione (costituisce il capside) o per esocitosi.

Ciclo litico

Porta alla distruzione della cellula ospite attraverso le fasi di:

• Aggancio
• Penetrazione
• Replicazione e sintesi
• Assemblaggio e rilascio con rottura della cellula

Ciclo lisogeno

Differisce dal ciclo litico perché l’informazione genetica del virus si integra con il DNA della cellula ospite. Quando la cellula si divide, produce nuove cellule con differente informazione genica. Questo ciclo può portare alla perdita dei freni inibitori della riproduzione cellulare e quindi alla produzione di massa di cellule tumorali.

Ciclo litico e lisogeno con infezione persistente

Esempio è il virus HIV (a RNA) che utilizza sia il ciclo litico che lisogeno. È un retrovirus con la capacità di utilizzare l’enzima trascrittasi inversa per trascrivere un RNA in DNA. Il capside e ciò che contiene viene inglobato dalla cellula perché i recettori CD4 della cellula umana lo riconoscono. Il capside si apre ed esce l’RNA che, tramite l’enzima trascrittasi inversa contenuto nel capside, da RNA forma DNA. Il DNA virale si integra con il DNA della cellula e produce da una parte un RNA per la riproduzione virale e la gemmazione di nuovi virus (ciclo litico senza rottura della cellula), dall’altra una cellula con informazione genica modificata e che si riprodurrà mantenendo le nuove caratteristiche (ciclo lisogeno).

Questa possibilità di avere entrambi i cicli è contraddistinta da una continua infezione, perché i virus verranno continuamente prodotti e le cellule continueranno a duplicarsi mantenendo la capacità di continuare a infettare.

Ciclo lisogeno con infezione latente

In questo caso vi è infezione che però trattiene i virus formati all’interno della cellula senza liberarli all’esterno.

Ciclo litico e lisogeno di uno stesso virus (es. SV40)

Il virus SV40, virus della scimmia che è arrivato all’uomo tramite vaccini e infezioni: infatti, il vaccino della poliomielite coltivato con substrato di rene di scimmia infetto da SV40 tra gli anni 1960/63 ha infettato larga parte della popolazione. Questo virus è alla base di tumori rari ma in aumento (mesoteliomi della pleura, tumori cerebrali ed osteosarcomi).

Infezione tramite coltivazione in vitro porta a un ciclo litico: le cellule di scimmia sono permissive all’infezione virale, cioè si fanno infettare e portano al completamento del ciclo litico.

Infezione in vivo con modello animale porta a ciclo lisogeno: le cellule animali in vivo non sono permissive, per questo motivo si ha un ciclo lisogeno che porta a formazioni tumorali.

Infezioni di cellule umane in vitro: si ha in questo caso un comportamento semipermissivo, cioè può essere attuato o il ciclo litico o il lisogeno. Può generare tumori attraverso ciclo lisogeno, oppure modificare il DNA cellulare e rimanere latente. Colpisce in particolare: fibroblasti, cellule mesoteliali e linfociti.

Replicazione del genoma virale

Replicazione virus ssDNA (Parvo Virus)

• Parvo Virus autonomi: cellule in attiva moltiplicazione.
• Parvo Virus defettivi: in cellule coinfettate da Adeno Virus.

Il genoma è formato da DNA(+) e DNA(-), che si complementa in strutture bicatenarie. Il DNA con sequenze ripetute invertite agli estremi si ripiega per funzionare da innesco (primer) per la sintesi di DNA complementare.

Meccanismo base replicazione virus a dsDNA

Sintesi dell’mRNA:

• Enzima RNA polimerasi DNA-dipendente (della cellula) copia l’elica (-) del dsDNA.
• Da DNA genomico proteina precoci, da DNA neoformato proteine tardive.

Sintesi del DNA:

• Sintetizzare alla cellula la propria DNA polimerasi (Adeno, Herpes, Pox).
• Utilizzano la DNA polimerasi della cellula (Papilloma, Polyoma).

NB: le proteine virali possono essere:

• Precoci: sintetizzate subito dopo la spoliazione, sono soprattutto di natura enzimatica e regolatoria. Intervengono nella replicazione dell’acido nucleico virale (polimerasi, ecc.).
• Tardive: sintetizzate dopo la replicazione dell’acido nucleico, sono soprattutto strutturali.

Meccanismo base replicazione virus a RNA

Per utilizzare l’RNA come stampo è necessario un enzima specifico: RNA polimerasi RNA-dipendente che non viene codificato dalle cellule ospiti, dunque deve essere codificato dal virus stesso. Le RNA pol RNA-dip virali producono sia mRNA che RNA genomico. L’mRNA prodotto è traducibile dai ribosomi cellulari, ma la cellula pone limitazioni alla replicazione virale, in quanto la cellula può tradurre solo mRNA monocistronici. Da ciò, il virus deve produrre o singoli mRNA per ogni proteina oppure un mRNA poliproteico che va scisso in mRNA minori. Al contrario, i virus che replicano nel nucleo cellulare non hanno problemi poiché si avvolgono della struttura replicativa della cellula.

Sul processo di come viene prodotto mRNA virale, si dividono i diversi tipi di replicazione.

Replicazione virus (-) ssRNA

La RNA polimerasi RNA dipendente DEVE essere presente nel virione poiché deve sintetizzare:

• Genoma RNA (+) intermedio di lunghezza completa che NON funziona da messaggero ma viene utilizzato per la sintesi del genoma.
• Deve sintetizzare mRNA + partendo da stampo di RNA -.

Caso particolare: virus a 2 molecole di RNA (+)

I genomi virali sono piccoli e compatti (3kb-300kb oppure vi sono alcuni virus giganti che arrivano a 1500 geni). Ricorda che il trasferimento genico nel ciclo lisogeno porta al trasferimento orizzontale (es. nei batteri porta a caratteri acquisiti).

Mutazioni genomiche dei virus

• Si verificano di norma durante processo di sintesi del nuovo genoma durante replicazione virale.
• I virus a DNA sono stabili dato il processo semiconservativo che consente correzione errori.
• I virus a RNA sono quelli che mutano maggiormente.
• Spesso una mutazione riguarda singola proteina e cambia solo le caratteristiche fenotipiche.
• Modifiche del capside o dell’envelope modificano le proprietà antigeniche compresa la proprietà infettante.

Interazioni genetiche dei virus

• Ricombinazione: scambio di porzioni di genoma tra due virus, la progenie virale ha caratteri fenotipici dei due virus parentali. Nei virus a DNA avviene per rottura e ricombinazione delle catene neosintetizzate. Nei virus a RNA questo processo avviene durante la replicazione.
• Riassortimento (solo per virus a DNA segmentato): scambio di segmenti di genoma tra virus della stessa specie che differenziano per qualche carattere (es. virus influenzali).

Interazioni non geniche

• Mescolamento fenotipico: genoma di un virus incorporato nel capside di un altro virus della stessa specie (es. poliovirus I e poliovirus II).
• Interferenza: si verifica quando la presenza di un virus in una cellula impedisce la moltiplicazione di un altro virus.
• Complementazione (tra virus della stessa specie o strettamente correlati): quando in un'infezione virale doppia la moltiplicazione di un virus è resa possibile dall’utilizzazione di una o più prodotti (proteine).

Fasi approfondite dell’infezione virale

Penetrazione

Può essere passiva (AIDS, rabbia, epatite B o flavivirus) con immissione diretta del virus nel circolo linfo-ematico o per inalazione o ingestione. I virus sfuggono a difese aspecifiche come muco, PH acido, sali biliari, enzimi proteolitici, ecc. Tendono a replicarsi nella zona di infezione poiché possiedono i recettori delle mucose.

Replicazione

• Primaria: il virus replica nel sito di infezione.
• Secondaria: avviene a distanza dal sito primario.

Le infezioni disseminate avvengono attraverso la via linfatica, ematica e neuronale. Il virus ha capacità di virulenza che gli fanno superare i meccanismi di difesa dell’ospite.

In seguito a infezione virale, diversi tipi di lesioni possono essere presenti:

• Infezioni citocide/litiche: il virus si replica nelle cellule infette, portandole a essere modificate irreversibilmente per apoptosi o necrosi. In vitro si osserva l’effetto citopatico (morte della cellula); in vivo negli organi si osservano immagini citoplasmatiche di degenerazione (es. herpesvirus e poxvirus).
• Infezioni latenti/recidivali: i virus realizzano un parassitismo controllato che permette alla cellula la sopravvivenza e la sua replicazione. In questo caso vi è spesso integrazione del genoma virale. Il virus permane senza produrre virioni infettanti. Da qui si hanno infezioni asintomatiche che possono rimanere latenti o riattivarsi.
• Infezioni persistenti/croniche: parassitismo virale controllato. Vi è produzione continua di antigeni virali. Le cellule non subiscono gravi danni ma sulla superficie dimostrano lievi lesioni date dalla risposta immunitaria. Da questo possono derivare malattie cronicamente evolute (es. epatite cronica da virus epatite B o C).
• Infezioni trasformante: con trasformazione si intendono modificazioni a cui vanno incontro le cellule in vitro ad opera di virus oncogeni. I virus oncogeni producono alterazioni della capacità replicativa cellulare, irregolarità morfologiche, anomalie cromosomiche, perdita dell’inibizione per contatto, capacità di dare colonie in agar. In soggetti immunodepressi provocano tumori.
• Lesioni dipendenti da coinvolgimento del sistema immunitario dell’ospite: lesioni a carico delle cellule e degli organi, in più vi è la capacità dei virus di infettare le cellule immunocompetenti (macrofagi e linfociti).

Microbioma e interazione con genoma del virus

Il microbioma include i microrganismi che compongono il nostro corpo (batteri, funghi, parassiti e virus). Questi organismi creano una rete che si relaziona con il nostro genoma e il nostro sistema immunitario: circa l’8% del genoma umano è composto da sequenze genomiche virali integrate nel nostro DNA originario, giocando un ruolo nella resistenza, suscettibilità ed infezione. Il microbioma influenza quindi anche gli esiti delle infezioni, con diverse ricerche a conferma del rapporto stretto tra difesa immunitaria e microbioma.

Oncogenesi virale

Le prime evidenze di relazione tra virus e tumori risalgono al XX secolo. Il cancro è la trasformazione della cellula in cellula tumorale e in seguito vi è crescita tissutale.

Nel 1911, P. Rous del Rockfeller Institute di NY scoprì che un virus (retrovirus) può causare cancro nei polli (Sarcoma di Rous). L’esperimento di dimostrazione di Payton Rous consisteva nel prelevare parte di un sarcoma da un pollo, rendere l’estratto acellulare tramite frantumazione e centrifugazione, e iniettare il prodotto in un pollo vivo. Nel sito di infezione si venne a creare un sarcoma. Ripeté l’esperimento purificando il prodotto da organuli e parti cellulari oltre che da batteri, il pollo sviluppò il sarcoma. Da ciò si capì che l’agente causa del sarcoma era molto più piccolo delle forme batteriche o cellulari.

Negli anni sessanta, Renato Dunbecco del California Institute di Pasadena scoprì che le cellule infettate da virus vengono trasformate. Negli stessi anni furono creati i primi test di tumorigenicità, prendendo delle cellule trasformate in vitro e iniettandole in vivo ad animali per verificare l’ipotesi sul ruolo virale nei tumori. Nel 1962, H. Temin della Wisconsin University scoprì la trascrittasi inversa. Nel 1970 fu scoperto il meccanismo della trascrittasi inversa e l’integrazione del provirus DNA nel genoma dell’ospite. Nel 1975 furono scoperti gli oncogeni.

Ruolo dei virus nell’oncogenesi

• I virus possono essere implicati nella patogenesi di tumori, definiti Oncovirus, infettano le cellule, si integrano a livello genico e promuovono l’espressione di fattori oncogeni e inibiscono i geni oncosoppressori.
• Gli oncovirus sono divisi in virus a DNA (deossiribovirus oncogeni) e virus a RNA (ribovirus oncogeni).