Tecniche di sequenziamento e analisi del DNA: dagli enzimi di restrizione al NGS

Funzione degli enzimi di restrizione

Gli enzimi di restrizione (o nucleasi di restrizione) sono enzimi in grado di tagliare il DNA in corrispondenza di sequenze specifiche, formate da 4 - 8 coppie di basi, spesso palindromiche, dette siti di restrizione. Alcuni enzimi di restrizione operano tagli netti in entrambi i filamenti di DNA, altri tagliano i due filamenti con uno scarto di alcuni nucleotidi, lasciando una breve sequenza di nucleotidi spaiati su ciascuna delle due estremità del taglio: queste sono dette estremità adesive, perché possono ricongiungersi sfruttando la complementarità tra le basi rimaste spaiate.

Tecnica dell'elettroforesi su gel

Trattando un tessuto con un certo enzima di restrizione si ottengono frammenti di DNA di lunghezze specifiche. L'elettroforesi su gel è una tecnica che sfrutta questa proprietà e consente di separare acidi nucleici o proteine in base alle loro dimensioni: il campione viene depositato su una piastra di gel di agarosio (o di poliacrilammide, nel caso di proteine) che viene poi posta in un campo elettrico, nel quale i frammenti di DNA (carichi negativamente) vengono attratti dall'elettrodo positivo.

Dato che la matrice del gel ostacola il movimento del campione, i frammenti più corti si muovono in essa più agilmente, mentre quelli più lunghi ne sono frenati e impiegano un tempo maggiore a percorrerla e così, dopo un certo tempo, i frammenti di DNA risultano distribuiti in diverse bande a seconda della loro lunghezza (o le proteine risultano distribuite in diverse bande a seconda della loro dimensione). Le bande, invisibili a occhio nudo, vengono rese visibili con coloranti che si legano al DNA e lo rendono fluorescente.

Anomalie del DNA e RFLP

Anomalie nella sequenza del DNA portano alla modificazione dei siti di restrizione, i quali non vengono più riconosciuti dai rispettivi enzimi di restrizione. La conseguenza è la formazione di frammenti di lunghezza diversa da quella attesa, indicati con la sigla RFLP ("polimorfismi della lunghezza dei frammenti di restrizione").

Utilizzo degli RFLP in genetica

Poiché le anomalie nella sequenza del DNA che originano gli RFLP sono mutazioni o polimorfismi (cambiamenti di singoli o di pochi nucleotidi normalmente presenti in una popolazione, non considerati mutazioni in quanto compaiono con una frequenza superiore all'1%), lo studio degli RFLP risulta utile per la diagnosi di alcune malattie genetiche e in analisi forensi (in quanto consentono di distinguere piccole variazioni nelle sequenze del DNA e quindi di attribuirle con precisione all'individuo da cui provengono). Confrontando la lunghezza dei frammenti derivati da una certa regione di DNA trattata con diverse combinazioni di enzimi di restrizione, è inoltre possibile costruire una mappa di restrizione, cioè l'insieme dei frammenti di DNA ottenuti con uno specifico enzima di restrizione, anche se la mappa definitiva di un tratto di DNA è data solo dalla determinazione della sequenza di nucleotidi.

Sequenziamento del DNA e metodo Sanger

I primi metodi di sequenziamento del DNA risalgono agli anni '70 del Novecento. Il primo DNA sequenziato completamente fu quello del batteriofago phi X 174 per mezzo del "metodo Sanger", dal nome del suo ideatore, Frederick Sanger, che vinse il suo secondo premio Nobel grazie a questa metodica.

Il sequenziamento Sanger (o "metodo dei terminatori di catena") si basa sul principio di complementarietà delle basi azotate dei nucleotidi che compongono i filamenti del DNA. Per determinare la sequenza esatta dei nucleotidi all'interno di un frammento di DNA si sfrutta il meccanismo replicativo: è perciò necessaria la presenza di un complesso enzimatico (DNA polimerasi), di specifici inneschi nucleotidici (primers), di deossiribonucleotidi tifosfato normali (dNTP) e di dideossiribonucleotidi trifosfato (ddNTP) marcati con quattro molecole fluorescenti diverse. Il metodo prevede l'incorporazione casuale di ddNTP, i quali bloccano il processo di replicazione e originano la formazione di numerosi frammenti che saranno in seguito analizzati tramite elettroforesi. Grazie al colore della molecola fluorescente, è possibile risalire all'ultimo nucleotide incorporato e proseguire a ritroso nel gel di elettroforesi, determinando così la sequenza di nucleotidi.

Evoluzione del sequenziamento: NGS

Il metodo Sanger è utilizzato ancora oggi, tuttavia nuove metodiche, che prendono globalmente il nome di Next Generation Sequencing (NGS), sono emerse recentemente e hanno abbattuto i costi di sequen-ziamento, soprattutto perché consentono di ottenere un numero elevato di sequenze contemporaneamente, in tempi rapidi e con tecniche relativamente semplici.

Un esempio di NGS consiste nel sequenziamento durante la replicazione del DNA: i quattro nucleotidi sono marcati con molecole fluorescenti diverse e, durante la sintesi del nuovo filamento, particolari strumenti sono in grado di leggere la fluorescenza dei nucleotidi nell'ordine in cui vengono incorporati, definendo quindi la sequenza del filamento.