Tecniche avanzate di analisi del DNA: identificazione, mappatura e sequenziamento

Qual è l'identificazione dei cloni specifici?

Esistono diverse tipologie di analisi del DNA:

1. Identificazione dei cloni specifici:

1.A Ibridazione con sonde (che riconoscono specifiche sequenze). Le sonde sono frammenti di DNA complementari a quello di interesse, caricati radioattivamente, e quindi in grado di emettere radiazioni quando sono legate al DNA. Guardando a quale frammento si legano è possibile capire quale è il clone desiderato. Il procedimento prevede:

-Si applica un filtro di cellulosa alla piastra con i batteri con plasmide ricombinato (la piastra originale viene conservata per l’ultimo step) (v. pagine precedenti);

-All’interno di un sacchetto sigillato si inseriscono il filtro con le colonie in crescita (dopo aver lisato le cellule e denaturato il DNA) e una soluzione contenente le sonde;

-Le sonde si legano al DNA di interesse, quelle che non si legano vengono lavate con una soluzione fisiologica;

-Si effettua l’autoradiografia del filtro (tecnica che sfrutta la capacità di alcuni composti radioattivi di impressionare una pellicola fotografica), si sviluppa l’autoradiogramma, in cui si vede quali colonie sono state marcate con la sonda, è quindi possibile capire quali colonie sulla piastra originale contengono il gene di interesse.

Rilevamento del prodotto genico

1.B Rilevamento del prodotto genico (cioè delle proteine). Come vettori si utilizzano i vettori di espressione, in grado di sintetizzare le proteine dei geni inseriti. Procediemento:

-I vettori di espressione producono le proteine di interesse;

-Si mette sulla piastra (che viene conservata) un filtro di cellulosa;

-Sul filtro ci sono le colonie in replica che producono le proteine di interesse;

-Si aggiungono gli anticorpi al filtro. Si sfrutta l’azione di anticorpi (resi radioattivi), che si legano alle proteine di interesse.

-Si effettua l’autoradiografia, che mostra la localizzazione delle colonie a cui si è legata la proteina.

Mappatura per restrizione

2. Analisi vera e propria:

2.A Mappatura per restrizione (tramite elettroforesi). le mappe di restrizione Sono rappresentazioni in cui si indica dove un enzima di restrizione effettua il taglio. Procedimento:

-Digestione del frammento di DNA tramite enzimi di restrizione. Il DNA viene digerito sia con un singolo enzima di restrizione che con più enzimi insieme;

-Viene effettuata l’elettroforesi dei frammenti;

-I frammenti vengono confrontati con un DNA standard;

-La lunghezza dei frammenti corrisponde alla distanza dei due siti di restrizione, questo permette di capire dove si trovano i siti di restrizione su quel frammento di DNA.

Sequenziamento del DNA

2.B Sequenziamento del DNA.L’biettivo del sequenziamento è di conoscere l’esatta sequenza delle basi azotate di un gene, e permette sia di confrontarlo con quello proveniente da altri organismi sia di conoscere le proteine che produce. Per il sequenziamento si usa un solo primer,quindi si copia un solo filamento. I filamenti vengono trattati con ddNTP (nucleotidi in cui manca l’O nel gruppo ossidrile). Poi i filamenti corrono sul un gel di poliacrilamide, tramite lo spettrografo.

Oggi i metodi di sequenziamento sono due (Southern blotting e Northern blotting), tuttavia esistono anche sequenziatori automatici.

Tecnica del Southern blotting

2.C Souther blotting: RFLP (tramite elttroforesi). È l’identificazione i frammenti di DNA tramite l’uso di sonde, quindi sfrutta la capacità di un frammento di legarsi ad un altro frammento complementare. Riassumendo il procedimento esso prevede:

-Estrazione del DNA;

-Trattamento con uno o più enzimi di restrizione;

-Elettroforesi, in cui si immerge il gel all’interno di una soluzione con TBE 10X. Si caricano i pozzetti con il DNA marcato e un marker.Con un ΔV di 100V tra il polo positivo e quello negativo il DNA migra verso il polo positivo. Tuttavia essendoci molti frammenti questi si dispongono in tante strisce continue, rendendone impossibile l’identificazione.

-Il DNA viene trattato e aperto;

-Il DNA viene impresso, tramite uno specifico procedimento, su una membrana di nylon, che sarà inserita in un sacchetto sterile e trattata con le sonde complementari ai frammenti di interesse. Le sonde, essendo cariche radioattivamente, attraverso l’autoradiografia rivelano la posizione dei frammenti.

Questa tecnica è utilizzata per la diagnosi di malattie genetiche e nell’RFLP.