Introduzione alle tecniche di laboratorio

Introduzione alle tecniche di laboratorio

Basi di clonaggio del DNA

Ci occupiamo della produzione di proteine ricombinanti, per poterne studiare la relazione tra struttura e funzione. Abbiamo a che fare con un'ampia serie di applicazioni che richiedono la produzione di proteine ricombinanti su scala industriale: fermentazione, purificazione e formulazione.

Ci occupiamo del processo che avviene in laboratorio: clonaggio di geni, preparazione di vettori di espressione e trasformazione dell’ospite di espressione. La produzione di proteine ricombinanti ha lo scopo di elaborare farmaci principalmente, es. insulina, fattori di crescita per la cicatrizzazione delle ferite.

Applicazione di proteine ricombinanti

• Proteine di interesse terapeutico, anticorpi, insulina, ormoni della crescita.
• Proteine di interesse commerciale, enzimi.
• Proteine da utilizzare come antigeni per la produzione di anticorpi policlonali e monoclonale.
• Reagenti per la ricerca di base e applicata.

Produrre una proteina ricombinante richiede un procedimento in cui una cellula ospite viene istruita per compiere il seguente processo. Abbiamo bisogno di un gene donatore che codifica per la proteina di interesse e un sistema eterologo, ovvero diverso rispetto a quello da cui proviene il gene di interesse, che fornisca il macchinario per la trascrizione e traduzione e produca la proteina di interesse, che dovrà foldarsi per svolgere la sua funzione biologica.

Questo è necessario in quanto il gene donatore potrebbe avere un'origine estremamente varia e potrebbe essere molto difficile estrarre il materiale come tale, es. specie in cui è presente, la produzione del prodotto è molto piccola oppure difficilmente raggiungibile, come animali pericolosi. Per produrne in quantità industriali ci serve questo processo.

Come avviene il clonaggio

Il gene donatore potrebbe derivare da un tessuto o una piccola parte di un organismo di origine. Il procedimento prevede l’isolamento del gene target, quindi della piccola sequenza codificante per una certa proteina, l’inserimento di questo in un vettore, spesso DNA circolare plasmidico, che deriva da DNA di provenienza batterica.

Questo DNA plasmidico, spesso derivante da batteri, è in grado di autoreplicarsi nelle cellule batteriche di origine. Esistono anche plasmidi provenienti da eucarioti, es. cellule di lievito. Andando a integrare il gene di interesse con il DNA plasmidico, si ottengono delle molecole di DNA ricombinante, che vengono trasferite in cellule ospiti.

Una volta che questo ha avuto successo, si necessita l’amplificazione di questo DNA plasmidico nella cellula ospite di tipo batterico.

Questa non è l’unica via con cui noi possiamo clonare il DNA, altre possibilità sono offerte dalla metagenomica, che è lo studio di materiale genetico recuperato direttamente da campioni ambientali. In questo caso da un campione ambientale, questo viene processato e in particolare è sottoposto a processamento del DNA, che grazie a sequenziamento permette tramite specifici programmi di banche dati il riconoscimento di una precisa funzione associata a una certa proteina. Questo accade quando alcune specie microbiche non possono essere coltivate. La determinazione della struttura e della funzione di una proteina si individua confrontandola con altre proteine di cui già è nota la struttura e sulla base della somiglianza delle sequenze posso arrivare a comprendere l’eventuale struttura e funzione della proteina ignota. Grazie a queste informazioni posso utilizzare il tratto di DNA in questione. I processi di metagenomica permettono un ampliamento delle informazioni riguardo alle proteine e quando sono interessata alla produzione di una certa proteina o enzima con certe caratteristiche, posso andare a consultare un database. Sulla base delle sequenze di proteine al quale siamo interessati si vanno a sintetizzare DNA che permettono la produzione in forma ricombinante della proteina in cellule batteriche.

Tutta la parte quindi di isolamento del gene, incorporazione del vettore ecc. grazie a questi processi può essere saltata e farci produrre direttamente da aziende specializzate il DNA utile con metodi chimici che ci permette di sintetizzare la molecola di interesse. Può essere sintetizzato solo il gene target o l’insieme gene + vettore.

Clonaggio del gene

Clonaggio di DNA: la produzione di copie multiple di un frammento di DNA, dal quale deriverà la produzione di una certa proteina. Questa sequenza è responsabile di molte cose, come per esempio piante resistenti a pesticidi.

DNA target: il gene che deve essere clonato ed espresso.

Carrier DNA: molto spesso è un plasmide, una molecola di DNA circolare che è in grado di replicarsi essa stessa, in modo separato dal resto del materiale genetico della cellula ospite. I plasmidi sono ideali da utilizzare per 2 ragioni: sono molto versatili e possono trasportare qualsiasi gene, ma possono anche passarlo da uno all’altro. Generalmente come organismo ospite si utilizza E. coli.

Cloning steps

Il processo è generalmente enzimatico.

• Abbiamo una fonte di DNA dalla quale si isola il DNA target e il vettore di clonaggio, il plasmide ricevente.
• Si esegue una reazione enzimatica di frammentazione che consente di escidere il frammento di DNA corrispondente al gene e che consente di linearizzare il DNA plasmidico.
• Si ha un’altra reazione enzimatica che consente la ligazione, ovvero l’unione tra i due frammenti a ottenere un DNA plasmidico ricombinante.
• Il DNA plasmidico deve essere trasferito e amplificato all’interno di cellule di E. coli, e poi il DNA viene estratto e purificato dalle cellule che abbiamo utilizzato. Per l’amplificazione.
• In seguito, questo viene utilizzato per la trasformazione di cellule ospiti per la produzione della proteina ricombinante, e si tratta generalmente di cellule batteriche. Il DNA quindi, viene estratto dal ceppo di amplificazione e viene utilizzato per trasformare il ceppo ospite e la produzione della proteina, si possono usare anche cellule di mammifero. La proteina prodotta può essere oggetto di purificazione, estrazioni ecc.

Gli enzimi utilizzati nei primi step sono enzimi di restrizione, delle fosfatasi, trasferimento gruppi fosfato, e delle ligasi.

Alcuni enzimi di restrizione possono essere utilizzati come strumenti di clonaggio. La loro origine deriva dall’identificazione di meccanismi di difesa che vengono attuate da cellule batteriche che possono degradare DNA esogeno attraverso l’utilizzo di enzimi che possono frammentare il DNA, di origine virale, degradandolo. Esistono varie famiglie di enzimi di restrizione, ma quelli che noi usiamo per il clonaggio genico sono quelli che appartengono alle endonucleasi di tipo II, questi enzimi riconoscono e tagliano sequenze palindromiche di DNA, lunghezza di 4-8 paia di basi.

Queste vengono tagliate in precisi punti attraverso sequenze riconosciute dagli enzimi. Una sequenza palindromica è una sequenza che può essere letta nello stesso modo da sinistra verso destra e viceversa.

Es. 5’- G/AATTC - 3’

3’ - CTTAA/C - 5’

Gli enzimi di restrizione riconoscono in modo specifico la sequenza target sul DNA, attraverso un meccanismo di diffusione lineare. L’enzima prende contatto con la molecola di DNA e scorre sul filamento fino al riconoscimento della sequenza di taglio. Questi richiedono per la catalisi degli ioni magnesio, che devono essere presenti in soluzione, e ciascun enzima di restrizione potrebbe richiedere specifiche condizioni, richiedono tamponi di funzionamento specifici. Gli enzimi di restrizione vengono forniti da aziende specializzate.

La diffusione lineare è data dal fatto che la molecola di DNA e l’enzima formano un complesso che non è così saldo come quando avviene il riconoscimento con la specifica sequenza di taglio. Quando avviene il riconoscimento della sequenza specifica il complesso diventa più compatto e avviene la reazione di rottura del legame fosfodiesterico, es. enzima di r, EcoR5. Il meccanismo di catalisi è altamente specifico e richiede ioni magnesio integrati nel buffer di reazione. Un esempio è quello di EcoR1, che funziona come dimero, scorre e quando riconosce la sequenza si attiva tramite modificazione conformazionale. In questo modo avviene il taglio, che richiede anche la complementarietà di tipo strutturale tra una serie di residui e di basi nucleotidiche. Una volta avvenuto il taglio il complesso si scioglie, e avremo una molecola di DNA e enzima che torna libero.

Ci sono anche enzimi che funzionano in modo monomerico tagliando da entrambe le parti il DNA.

Esempi di endonucleasi di restrizione sono EcoR1, BamH1, Hind3, EcoR5 ecc. Il sito di taglio si trova all’interno del sito riconosciuto palindromo. Solo nel caso di EcoR5 il sito di taglio coincide nello stesso punto sui due filamenti. Una volta che il DNA è stato tagliato si originano estremità definite Sticky, dal fatto che ciascuna di queste estremità contiene una sequenza che protrude rispetto al punto in cui avviene l’appaiamento con l’altro filamento sul DNA.

Abbiamo su ciascun filamento un’estremità protrudente, che nel caso a lato fa sì che su ciascuno di questi l’estremità protrudente è al 5’, si hanno quindi estremità coesive. Non è l’unica possibilità, dipende dall’enzima che utilizziamo. Esistono anche estremità piatte, blunt end, che fanno sì che non ci sia alcuna estremità protrudente.

Nel caso di estremità coesive, EcoR1, il taglio è sfalsato sui due filamenti, sticky end, e possono formarsi code complementari in grado di ibridizzare. Nel caso di estremità piatte, Hae3, il taglio avviene in posizioni allineate sui due filamenti, blunt end, tutte le basi sono quindi appaiate senza estremità protrudenti.

EcoR1: genere = Escherichia, specie = coli, ceppo = R, ordine di caratterizzazione da un certo organismo = 1, il primo a essere stato caratterizzato da quell’organismo. Genere, specie vengono scritti in corsivo.

Diverse tipologie di plasmidi

Un plasmide è una molecola circolare di DNA a doppio filamento, in grado di replicarsi autonomamente dal cromosoma.

Un plasmide possiede, es. pBR322:

• Un’origine replicativa, ori.
• Almeno un gene per la resistenza ad antibiotico, per selezionare la presenza del plasmide.
• Un multicloning site, o polylinker, una regione di DNA, contenente diversi siti di taglio per enzimi di restrizione. Quanto maggiore è il numero di enzimi di restrizione nel polylinker, tanto maggiori sono le opportunità di clonare frammenti di DNA che siano delimitati da sequenze differenti. Si tratta di rendere compatibili le sequenze di DNA plasmidico, con quella della molecola di DNA che vogliamo clonare al suo interno.

pBR322 è un plasmide di origine artificiale che deriva dalla modificazione di un plasmide di tipo naturale di E. coli.

Il clonaggio dipende dal fatto di generare estremità compatibili tra molecola di DNA accettore, rispetto a quella del DNA donatore. Il legame tra le due molecole potrà avvenire in modo semplice se si generano estremità utilizzando lo stesso enzima di restrizione.

Un sito di restrizione all’interno di un plasmide e un tratto di DNA vengono tagliati con lo stesso enzima di restrizione generando sticky end. Questo permette l’appaiamento tra le estremità che avviene in modo spontaneo, in quanto utilizzando lo stesso enzima di restrizione, es. EcoR1, si generano estremità compatibili. Le estremità protrudenti devono essere complementari sul plasmide e sul tratto di DNA da integrare in esso, questa condizione fanno sì che le estremità sono sticky in quanto c’è una complementarietà diretta tra le estremità generate su frammenti diversi dallo stesso enzima di restrizione.

Ancora prima di catalizzare il legame tra queste, le estremità tendono ad annilare spontaneamente. Questo non accade quando ho estremità piatte, in quanto fanno sì che i frammenti generati da qualunque plasmide possano accogliere un frammento generato con qualunque enzima di restrizione.

Le estremità si appaiano spontaneamente, ma è possibile anche il riappaiamento delle estremità del plasmide. L’inserimento del DNA può avvenire in entrambi gli orientamenti. Ciò che a noi interessa è un perfetto annealing tra le estremità protrudenti, l’appaiamento può avvenire tra estremità compatibili.

Si può avere quindi l’ibridazione delle estremità e ligazione oppure re-annealing, quando le estremità del plasmide si riappaiano.

Per ovviare al problema, si possono usare degli enzimi che vanno a modificare il DNA, per esempio fosfatasi che idrolizzano il gruppo fosfato all’estremità 5’ protrudente del vettore e questo produce l’incapacità di reannilare.

Clonaggio con estremità non compatibili

Il re-annealing rischia di diminuire l’efficienza del clonaggio e un altro metodo che può essere usato è l’utilizzo di due enzimi di restrizione differenti, es. EcoR1 e BamH1. Questo porta la comparsa di estremità sull’inserto e sul plasmide che non sono compatibili tra loro. In questo caso, il re-annealing del plasmide non potrà avvenire a causa dell’incompatibilità delle sequenze protrudenti, ma potrà avvenire solo l’appaiamento con l’inserto che presenta estremità tagliate anch’esse con EcoR1 e BamH1 e quindi compatibili con le due presenti sul vettore. Abbiamo la possibilità di direzionare l’inserto sul DNA plasmidico.

È possibile inoltre con minore probabilità che si inserisca una molecola di DNA non perfettamente complementare, andandosi a creare una bolla dove non avvengono i legami a idrogeno tra le basi, questo accade raramente però. Una volta che la molecola si annila perfettamente, si forma un appaiamento non stabile definito nickato, ovvero molecole di DNA con basi non perfettamente allineate, discontinue sui due filamenti in quanto il legame fosfodiesterico non è ancora avvenuto. Il legame fosfodiesterico a livello dei siti di taglio viene ripristinato dall’enzima DNA ligasi, in un processo noto con il nome di ligazione. La ligasi forma un legame covalente tra il gruppo P 5’ di un’estremità e il gruppo 3’ OH della catena adiacente. Per avvenire è necessario ATP che si scinde in AMP + PPi.

La DNA ligasi utilizzata è generalmente la T4 DNA ligasi per la modificazione del DNA, questa deriva da un virus batteriofago T4. Il buffer di reazione contiene ATP all’interno di un tampone adatto che permette il funzionamento dell’enzima.

Per poter accelerare la reazione viene aggiunto Polyetilen Glicol che ha la funzione di porre in prossimità la molecola di DNA con quella dell’enzima, creando un affollamento molecolare in soluzione che evita la diffusione delle molecole. Accelera dei fenomeni di diffusione lineare.

La struttura della T4 DNA ligasi è quella di un complesso enzimatico che da un punto di vista strutturale è intermedia tra quella umana e quella virale. La molecola proteica è avvolta attorno all’asse del DNA.

Trasformazione batterica, selezione e screening

L’amplificazione del DNA permette di amplificare il DNA plasmidico ottenuto da clonaggio, in modo da possederne in grandi quantità. Il prodotto di ligazione, ovvero il DNA plasmidico, viene prodotto in piccole quantità tramite il clonaggio, è necessario quindi un processo di amplificazione che avviene in vivo, trasformando opportuni ceppi batterici di Escherichia coli. L’uso di tali ceppi batterici esula dal tipo di ospite, verrà utilizzato per la produzione della proteina ricombinante.

Questo è possibile per DNA circolari e che contengono origini di replicazione.

I ceppi di batterio di Escherichia coli fungono da ambienti in cui viene promossa l’amplificazione della molecola di DNA.

È necessario che avvenga una trasformazione, l’assunzione di DNA plasmidico da parte di un organismo utilizzato come ospite, si ha un isolamento delle cellule con il gene clonato e avverrà poi la moltiplicazione del vettore. I trasformanti, ovvero le cellule che hanno inglobato il DNA circolare devono essere in condizioni di poter moltiplicarsi, quindi verranno poste in un terreno ricco, 37 gradi in modo che ci sia agitazione e si favorisca l’ossigenazione della coltura. In queste condizioni aumenta il numero di cellule e in questo modo aumenta anche il numero di DNA plasmidico.

Un’ulteriore risorsa può essere quella di utilizzare plasmidi ad elevato numero di copie, ovvero plasmidi che subiscono un controllo molto basso per quanto riguarda il numero di molecole presenti all’interno della cellula. In questi casi si ha una quantità ancora più elevata di DNA plasmidico nelle cellule, che poi verrà estratto in modo selettivo. Il controllo più o meno stretto sul numero di copie di DNA plasmidico nella cellula dipende dalle caratteristiche dell’origine di replicazione del DNA plasmidico. I vettori di clonaggio di DNA sono generalmente ad alto numero di copie per consentire questo meccanismo.

I vettori di espressioni delle proteine al contrario sono caratterizzati da un minor numero di copie, alcune decine o un centinaio. Si replicano poco all’interno delle cellule, infatti la loro funzione è tutt’altra.

Per poter essere trasformate le cellule di Escherichia coli è necessario un pretrattamento. Le cellule di E. coli non competenti non possono essere trasformate dal DNA ambientale, devono quindi essere rese competenti per poter essere trasformate da DNA ambientale. Questo in quanto normalmente le cellule di E. coli non presentano sulla membrana dei macchinari molecolari che siano adeguati e