Introduzione tecniche laboratorio - Appunti

Metodi del DNA ricombinante per il clonaggio e la produzione di proteine ricombinanti

Occuparsi di proteine ricombinanti significa che si può studiare la relazione tra struttura e funzione della proteina, che permette di comprendere quali sono i determinanti di sequenza o struttura o il dominio nello svolgimento della sua funzione. Le funzioni possono essere relativamente semplici come quelle degli enzimi oppure più complesse, che si studiano con esperimenti biochimici.

Il lavoro si basa sul formulare delle ipotesi sulla funzione di un determinato elemento strutturale e vedere cosa accade quando lo si modifica, quindi si svolgono mutazioni sito dirette su un elemento che poi viene prodotto in forma ricombinante. Oltre a questo, vi è un mondo di applicazioni nella produzione di proteine ricombinanti, che ha a che vedere con la preparazione di proteine con ruoli diversi come enzimi usati come additivi o proteine con ruolo farmacologico.

Gli step della fase industriale sono la fermentazione, quindi l’estrazione della massa di proteine, oppure la purificazione o la formulazione del preparato che contiene un principio attivo dato dalla proteina. Affiancate alle attività industriali troviamo quelle di laboratorio: clonaggio di geni, preparazione di vettori di espressione e trasformazione dell’espressione dell’ospite.

Applicazioni di proteine ricombinanti

• Proteine di interesse terapeutico (anticorpi, insulina, ormone della crescita).
• Proteine di interesse commerciale (enzimi come gli additivi dei detersivi).
• Proteine da utilizzare come antigeni per la produzione di anticorpi policlonali e monoclonali.
• Reagenti per la ricerca di base e applicata.

Molti enzimi sono anche usati per l'esecuzione di protocolli di biochimica o biologia molecolare. Produrre una proteina ricombinante significa che una cellula ospite viene istruita per realizzare questo processo: necessitiamo di un gene che codifica per la proteina di interesse e di un sistema eterologo (diverso da quello del gene) che fornisca il macchinario per la trascrizione e traduzione fino ad arrivare alla proteina di interesse finale.

I motivi che spingono all’utilizzo di un sistema ricombinante sono legati al fatto che il gene donatore può avere un’origine varia e potrebbe essere particolarmente difficile un’estrazione diretta di questo materiale, come se nella specie in cui è presente ne venga fornito in piccole quantità oppure l’animale è accessibile.

Clonaggio

Il gene donatore potrebbe derivare da un tessuto della specie di origine. Il procedimento prevede l’isolamento del gene target, una piccola sequenza codificante di una proteina di interesse, e l’inserimento in un DNA vettore (plasmidico spesso di provenienza batterica). La combinazione del DNA all’interno del DNA plasmidico fa ottenere molecole di DNA ricombinante che dovrà essere trasferito in una cellula ospite. L’amplificazione del DNA avviene generalmente in una cellula batterica.

Questo non è l’unico modo di clonare il DNA perché troviamo anche altri processi messi a punto dalla metagenomica, che è lo studio del materiale genetico che viene recuperato da campioni ambientali. I campioni ambientali saranno sottoposti ad un processamento ed in particolare ad un processamento del DNA che ci dà la possibilità attraverso il sequenziamento di DNA di riconoscere specifiche funzioni.

Ad esempio, materiali contaminati da un idrocarburo risultano in realtà sottoporsi ad un processo di sanificazione e detossificazione operato da microorganismi che saranno selezionati in loco. Questi microorganismi possono essere di difficile coltivazione (no possibilità di isolare le specie microbiche e di produrre enzimi per detossificarlo). Ciò non toglie la possibilità di isolare DNA proveniente dal sito e attraverso tecniche di sequenziamento e confronto (tecniche di analisi bioinformatica) di andare a risalire a quali siano le funzioni enzimatiche principalmente coinvolte nel processo.

Il successo della metagenomica è dato dalla possibilità di riconoscere delle funzioni attraverso l’analisi bioinformatica. Dal confronto del DNA isolato con quelli nelle banche dati posso riconoscere le varie funzioni grazie ad altre proteine o enzimi di simile sequenza già studiati.

Clonaggio del DNA

Questo processo di clonaggio ha dietro una fase di progettazione attiva. Il clonaggio del DNA consiste nella moltiplicazione delle copie identiche di DNA da cui deriverà la produzione di una proteina. La sequenza genica viene moltiplicata e inserita nel circoletto di DNA che è il vettore che consente l’amplificazione del DNA. I circoletti di DNA contengono elementi di replicazione autonoma che gli consentiranno di moltiplicarsi nelle cellule in cui verranno posti.

Il DNA target indica la sequenza genica codificante per la proteina di interesse. Dovrà essere clonato ed espresso. Il DNA Carrier è considerato il DNA plasmidico in cui il gene di interesse viene inserito. Sono in grado di replicarsi da soli separatamente dall’altro materiale genetico della cellula ospite. Generalmente la fase di amplificazione del plasmide avviene in cellule di Escherichia coli, che rappresenta il modo più semplice che abbiamo per manipolare del DNA ricombinante, il quale può essere estratto da e.c. e usato per trasformare l’ospite di espressione vera e propria (quello usato per produrre la proteina con le caratteristiche strutturali e funzionali desiderate).

Fasi del clonaggio

• DNA originario che contiene il DNA target e il plasmide in cui dovrà essere inserito il DNA.
• Frammentazione enzimatica che consente di scindere il DNA target e di linearizzare il plasmide.
• Reazione enzimatica che consente la ligazione del DNA target e il plasmide ottenendo il DNA plasmidico ricombinante.
• Amplificazione con trasporto in cellule di Escherichia coli: DNA plasmidico deve essere estratto e purificato.
• Il DNA plasmidico è usato per trasformare la cellula ospite.
• Produzione della proteina ricombinante.

I primi tre punti sono caratterizzati dall’azione di enzimi: enzimi di restrizione, fosfatasi e ligasi. Questi costituiscono il tool box, cioè l’insieme di strumenti minimi per fare lavori di biologia molecolare.

Enzimi di restrizione

Gli enzimi di restrizione vengono usati come sistemi di clonaggio. Sono stati scoperti grazie all’identificazione di meccanismi di difesa di cellule batteriche in quanto enzimi batterici possono degradare DNA esogeno. Ne esistono varie famiglie, ma quelli usati come cloning tools sono le endonucleasi di tipo II.

Gli enzimi di restrizione riconoscono e tagliano sequenze palindromiche (possiamo leggere ugualmente da sinistra a destra e viceversa). Come agiscono: il binding sulla sequenza di DNA è non specifico. Gli enzimi di restrizione riconoscono la sequenza target sul DNA attraverso un meccanismo di diffusione lineare. Quindi l’enzima scorre sulla molecola fino al raggiungimento della sequenza di taglio. Per la catalisi vengono usati degli ioni magnesio.

Ciascun enzima di restrizione potrebbe richiedere condizioni peculiari di funzionamento. Le conoscenze su questi enzimi si sono tanto sviluppate che sono stati formati dei tamponi universali, cioè elementi indispensabili per il funzionamento di un ampio repertorio di RE.

Nell’immagine vediamo lo scorrimento di RE lungo il DNA, si ha un complesso non specifico in quanto la struttura non è molto salda finché non si arriva al tratto desiderato. Il riconoscimento in corrispondenza di una molecola di DNA palindromico porta il complesso a compattarsi, in complesso specifico si ferma e avviene la catalisi. Nella catalisi si ha la rottura del legame fosfodiesterico. Gli ioni magnesio sono distribuiti insieme al buffer di reazioni. Sia EcoRI che EcoRV sono di tipo IIP e funzionano come dimeri.

La rottura del legame prevede anche la complementarietà strutturale tra una serie di residui e basi nucleotidiche. Dopo la rottura il complesso si scioglie, ottenendo una molecola di DNA e quella dell’enzima.

Sito di taglio degli enzimi di restrizione

Per tutte le endonucleasi di restrizione, il sito di taglio si trova all’interno del sito riconosciuto. In EcoRV il sito di taglio è allineato sui due filamenti. Il taglio può portare alla formazione di estremità sticky in cui entrambe contengono una sequenza che protrude rispetto al punto in cui avviene l’appaiamento. Nell’esempio C e G sono l’ultimo punto della sequenza alle due estremità in cui i due filamenti sono perfettamente appaiati.

Su entrambi i filamenti troviamo un’estremità protrudente che è solitamente indicata secondo l’orientamento del filamento. Dopo il taglio G si trova in 5’ quindi spostandosi da essa si va verso l’estremità 3’-OH, lo stesso vale per C che tende a 3’ quindi spostandosi verso A andiamo verso l’estremità 5’-P. le estremità protrudenti si trovano a 5’ di entrambi i filamenti.

Il taglio è sfalsato sui due filamenti (sticky end), si possono formare «code» single strand complementari, in grado di ibridizzare. Ma troviamo anche il taglio come in EcoRV, che produce estremità blunt (piatte). Non ci sono elementi protrudenti alle estremità, ma il taglio avviene in posizioni allineate sui due filamenti.

La denominazione EcoRI è definita: E dal genere da dove è stato isolato (Escherichia), co sta per coli, R sta per il ceppo e poi si ha il numero dell’ordine di caratterizzazione da un certo organismo (I,II..).

Vettori di clonaggio: plasmide

Un plasmide è una molecola circolare di DNA a doppio filamento, in grado di replicarsi autonomamente dal cromosoma. Un plasmide possiede:

• Un’origine replicativa (ori).
• Almeno un gene per la resistenza ad antibiotico, per selezionare la presenza del plasmide.
• Un multicloning site (o polylinker) contenente diversi siti di taglio per enzimi di restrizione. È una regione del DNA in cui sono presenti diversi siti di taglio per enzimi di restrizione. Maggiore è il numero di RE presenti in esso tanto maggiori sono le opportunità per noi di clonare frammenti di DNA.

Si tratta di rendere compatibili le sequenze di DNA del circoletto di DNA plasmidico con quella della molecola che vogliamo clonare al suo interno. Il clonaggio dipende dal fatto di generare delle estremità compatibili tra la molecola di DNA accettore e la molecola del DNA donatore. Il legame tra le due molecole di DNA può avvenire in modo semplice se ci si mette nelle condizioni di generare dei frammenti usando lo stesso enzima di restrizione.

Un sito di restrizione come Escherichia coli presenta un multicloning site che ci dà la possibilità di clonare al suo interno delle estremità che sono state generate con lo stesso enzima di restrizione (es. due estremità con EcoRI). Quindi:

• Le estremità si appaiano spontaneamente, ma è possibile anche il riappaiamento delle estremità del plasmide.
• Plasmide e DNA estraneo vengono tagliati con lo stesso enzima di restrizione, che genera sticky end.
• L’inserimento del DNA può avvenire in entrambi gli orientamenti.

Le estremità protrudenti del frammento devono essere complementari a quelle del DNA plasmidico. Per questo queste estremità sono dette sticky, cioè appiccicose, dipende dalla complementarietà diretta tra le estremità che vengono generate su frammenti diversi da parte dello stesso RE. Prima ancora di poter catalizzare la reazione del legame fosfodiesterico tra le estremità, queste tenderanno ad annilare per effetto della loro complementarietà.

Ciò non accade con enzimi che creano estremità piatte perché esse fanno sì che i frammenti generati da un qualunque plasmide possano accogliere un frammento generato con RE. Dopo il processo di ligazione, il DNA ricombinante deve essere amplificato. L’amplificazione avviene in vivo, trasformando opportuni ceppi batterici di Escherichia coli. L’uso di tali ceppi batterici esula dal tipo di ospite verrà utilizzato per la produzione della proteina ricombinante.

Trasformazione dell'Escherichia coli

La trasformazione di un ceppo ospite di Escherichia coli è il passaggio che consente l’amplificazione in vivo. Perciò io prendo la miscela di ligazione in cui si sono formate un numero piccolo di DNA ricombinante, ci trasformo delle cellule di e.c. che funge da incubatore e va avvenire la replicazione del DNA plasmidico, questo è possibile per molecole di DNA integre e circolari che contengono l’origine di replicazione.

Devo distinguere molecole che hanno internalizzato il DNA plasmidico rispetto alle altre (possono trovare frammenti dell’inserto o del vettore). Il mio obiettivo è quello di distinguere le molecole di e.c. trasformate con la molecola di interesse. Spesso si parla di vettori shuttle che consentono l'amplificazione del DNA plasmidico nella cellula di e.c. e poi ad esempio il trasferimento in cellule di lievito per la loro produzione.

In generale, la trasformazione indica l’assunzione di DNA da parte di un organismo. Ci aspettiamo che il circoletto di DNA sia trasferito all’interno dell’e.c. le cellule di e.c. trasformate, dette trasformanti, verranno messe in condizione di moltiplicarsi quindi in un terreno ricco, 37 gradi, in agitazione per favorire l’ossigenazione della coltura. L’amplificazione del numero di cellule trasformanti è un evento che produce la moltiplicazione dei circoletti di DNA.

C’è un’altra risorsa nel tema dell’amplificazione in vivo in cui i plasmidi utilizzati possono essere a numero elevato di copie. Un plasmide ad alto numero di copie subisce un controllo molto basso del numero di molecole presenti nella cellula. Se di DNA genomico è 1,5 molecole, mentre quello dei circoletti è più elevato di decine a centinaia di copie. Il controllo più o meno stretto è dato dalle caratteristiche dell’origine di replicazione del DNA plasmidico. Tutti i DNA plasmidici rivolti al clonaggio DNA sono di solito dei vettori ad alto numero di copie. Al contrario, i vettori di espressione delle proteine sono caratterizzati a un minor numero di copie (10-100).

Le cellule di e.c. per poter essere trasformate richiedono un pretrattamento. Di per sé queste cellule non possono essere trasformate dal DNA ambientale, ma le cellule di E. coli devono essere «rese competenti» per poter essere trasformate da DNA ambientale. Sulla loro membrana esterna non possiedono dei macchinari molecolari deputati all’internalizzazione del DNA. Le cellule acquisiscono una competenza all’internalizzazione per prendere il DNA ambientale.

I trattamenti che rendono le cellule competenti hanno due funzioni:

• Ridurre la carica delle molecole di DNA (gruppi fosfato danno cariche -). L’internalizzazione può essere ostacolata dal fatto che anche le membrane cellulari sono dotate di cariche negative.
• Sfruttare dei canali di accesso e bisogna bypassare l’assenza di meccanismi molecolari che siano adeguati e specifici per il trasporto di DNA. Si sfruttano dei micropori oppure si possono generare con il trattamento dell’elettroporazione.

Nel 1970 Mandel and Higa: batteri trattati con soluzioni di CaCl₂ e riscaldati velocemente, potevano essere trasformati con DNA esogeno; quindi, questo trattamento conferiva ai batteri un transiente stato di “competenza”. La competenza è la capacità di assumere DNA. Nel corso degli anni sono stati fatti diversi tentativi per migliorare l’efficienza di trasformazione. Le tecniche più utilizzate oggi sono: Trasformazione per CaCl₂ e Elettroporazione.

Inizialmente si ha la fase di pretrattamento della colonia di e.c. a 37 gradi, nel terreno ricco e in agitazione per favorire l’ossigenazione fino alla fase esponenziale.

Fasi della crescita batterica

Fase di latenza: intervallo di tempo in cui i microrganismi si adattano al substrato (non si moltiplicano).

Fase esponenziale: periodo di tempo in cui i microrganismi si moltiplicano in modo progressivo e costante. Non troviamo cellule in fase di senescenza o morte cellulare. Hanno una parete cellulare non spessa. Sembrano più frequenti sulla membrana plasmatica la presenza di pori/discontinuità attraverso le quali si può verificare l’accesso di DNA.

Plateau: si stabilisce un equilibrio tra il numero delle cellule che si moltiplicano e il numero di cellule che muoiono.

Fase della morte: cessa la moltiplicazione dei microrganismi che invecchiano e muoiono.

Per indurre lo stato di competenza si utilizza soluzioni di cloruro di calcio o cloruro di rubidio o magnesio che neutralizzano le cariche sulla superficie e sulla molecola di DNA. Il trattamento con sali neutralizza le cariche negative delle teste di fosfato e del DNA. La neutralizzazione di queste cariche attenua la repulsione, consentendo al DNA di avvicinarsi alla cellula.

Tutti i trattamenti producono o una discontinuità nel doppio strato lipidico o aumentano la permeabilità di membrana per favorire l’internalizzazione del DNA. Il DMSO, dimetilsulfossido, aumenta la permeabilità rendendo più flessibile il doppio strato fosfolipidico e ciò aumenta la probabilità di attraversamento di essa. I cationi divalenti schermano le cariche negative sul DNA (dei gruppi fosfato). La combinazione di bassa temperatura e di cationi divalenti può aiutare a rendere più accessibili canali attraversabili da DNA. Ci vuole mezz’ora o un’ora, poi bisogna riportare le cellule in condizioni di ripristinare l’integrità della membrana.