L'importanza degli enzimi di restrizione nella biotecnologia moderna

Tecniche del DNA ricombinante

La chiave per capire l’attività delle cellule pareva inaccessibile finché non sono state sviluppate le tecniche del DNA ricombinante. Anche dopo la scoperta che l’informazione genetica era codificata nella sequenza del DNA, non era possibile studiare singolarmente i geni, poiché non erano disponibili tecniche che consentissero di isolare tratti di DNA dall’intero genoma.

Enzimi di restrizione

Grazie alla scoperta di una classe di enzimi batterici, gli enzimi di restrizione, è stato possibile risolvere questo problema, dando un impulso enorme alla ricerca genetica e allo sviluppo di nuove tecnologie. Gli enzimi di restrizione o nucleasi di restrizione rappresentano le “forbici molecolari” del biotecnologo: catalizzano l’idrolisi di un legame fosfodiesterico nella doppia elica di DNA e lo fanno in sequenze precise di poche coppie di nucleotidi, creando frammenti di diverse dimensioni. Gli enzimi di restrizione esistono già in natura: sono presenti nei batteri, dove vengono utilizzati contro le infezioni dei virus, poiché frammentano il DNA estraneo rendendolo non infettante. Il DNA batterico si protegge dall’azione dei propri enzimi di restrizione “metilando” le sequenze del proprio DNA che altrimenti verrebbero tagliate: l’aggiunta di gruppi metile (— CH_3), infatti, da parte di enzimi chiamati metilasi, rende queste sequenze non riconoscibili dalle endonucleasi.

Digestione enzimatica e sequenze bersaglio

Il processo di taglio del DNA da parte di un enzima di restrizione è detto digestione enzimatica e consiste nella rottura dei legami tra il gruppo ossidrile all’estremità 3' di un nucleotide e il gruppo fosfato all’estremità 5' del nucleotide successivo. Ogni enzima di restrizione taglia una sequenza specifica. Ad esempio: l’enzima Eco RI riconosce e taglia il DNA a livello della sequenza 5'-GAATTC-3', mentre la sequenza riconosciuta dall’enzima Hindi III è 5'-AAGCTT-3'. Le sequenze bersaglio sono generalmente corte, da 4 a 8 coppie nucleotidiche, e i siti di taglio si trovano casualmente in qualsiasi molecola di DNA. Molti siti di taglio sono palindromi, ossia sequenze che risultano identiche nei due filamenti, ma in direzione opposta, ad esempio: 5'-AAGCTT-3’ su un filamento, 3'-TTCGAA-5' sull’altro. Invece di tagliare le molecole in maniera netta, alcuni enzimi di restrizione eseguono un taglio sfalsato che dà origine a due estremità coesive (capaci cioè di riformare legami) a singolo filamento. Un qualsiasi DNA tagliato con questi enzimi può essere facilmente attaccato a un’al-tra molecola di DNA tagliata dallo stesso enzima. I biologi molecolari hanno attualmente a disposizione una grande quantità di enzimi di restrizione, purificati da microrganismi differenti. Utilizzando più enzimi contemporaneamente è possibile tagliare il DNA a livello di sequenze differenti, ottenendo frammenti, i cosiddetti frammenti di restrizione, di lunghezza diversa.