Genetica umana e medica

Genetica medica e umana

A.A. 2021/2022

Genetica medica e umana (A.A. 2021/2022) - Gensini Francesca

Lezione 1 (20.10) – Diagnosi prenatale

Cominciamo una serie di lezioni relative alla diagnosi prenatale, considerata come l'insieme delle indagini, strumentali e di laboratorio, non necessariamente genetiche, che sono finalizzate a cercare di capire se il feto presenti una patologia. Il compito di questo percorso prenatale è quindi di fare delle analisi per arrivare, quando ci si riesce, a capire perché quel bambino presenta delle problematiche.

Per avere un'idea dell'entità di cosa affrontiamo, è vero che se a fronte di una grande percentuale di bambini che nascono sani, c'è un 2% circa di bambini che nasce con un problema visibile alla nascita e un 1% di bambini che nasce alla nascita con problemi non visibili al momento della nascita. Addirittura, c'è un 8-10% di difetti congeniti che compaiono entro i primi 10 anni di vita.

I problemi presenti a livello fetale non sono però unicamente genetici; in parte è dovuto a anomalie cromosomiche, oppure a malattie monogeniche; quindi, patologie autosomiche dominanti/recessive dovute a singolo gene, oppure anomalie e malformazioni vere e proprie dovute né a un problema di cromosomi, né genetico, e hanno un meccanismo di tipo multifattoriale.

Ricordiamo soltanto che con queste malattie intendiamo quelle malattie dovute a più concause che si possono distinguere in cause genetiche più cause ambientali. I principali difetti congeniti multifattoriali sono quelli che riguardano i difetti cardiaci, seguiti da alterazioni dell'apparato genito-urinario. Molte di queste anomalie del bambino sono appunto multifattoriali di somma di fattori ambientali e genetici, ma lo stesso tipo di malformazione può essere anche invece cromosomica; per esempio, infatti una cardiomiopatia congenita compare nella sindrome di Down, malattia genica e non multifattoriale.

Le categorie dei difetti congeniti

I difetti congeniti li dividiamo di solito in tre categorie: dovuti a difetti cromosomici, difetti di origine genetica mendeliana e malformazioni che non hanno nessuna delle due cause. Sulla base del sospetto che abbiamo, si fanno analisi diverse. Se sospettiamo alterazione cromosomica possiamo fare cariotipo e analisi seguenti come MLPA o CGH array. Se il sospetto ricade su malattia monogenica come fibrosi cistica, facciamo analisi genetica su CTFR direttamente. Se invece non c'è un sospetto, si fanno ecografie senza analisi particolari. Infatti, per arrivare a fare analisi genetica dobbiamo fare procedure, come amniocentesi e villocentesi che hanno però un alto rischio di aborto e lo facciamo solo in casi conclamati di sospetto.

La consulenza genetica

Per valutare tutto questo si fa prima una consulenza genetica, che è appunto un percorso indispensabile soprattutto prima di fare analisi come amniocentesi e villocentesi che non soltanto hanno rischio di aborto, ma che non permettono poi di vedere tutti i difetti possibili. Tale consulenza si fa, in generale, come atto medico che si può fare in ogni atto della vita, in genere una coppia lo fa prima di una gravidanza eventuale, oppure proprio durante la gravidanza, quando è già in atto e si percepisce un rischio per il bambino. Oppure, se nasce un bambino che ha delle problematiche, si fa una visita genetica per capire se questo bambino ha una condizione su base genetica. In altri casi invece si fa anche su soggetto adulto ovviamente. In ogni caso, secondo le linee guida nazionali e internazionali, la consulenza è raccomandata ogni volta che si fa un test genetico. Infatti, prima del test, quando è importante spiegare cosa si va a fare, e dopo la risposta dell'esame proprio per spiegare i risultati del test genetico.

Lo scopo di questa consulenza è intanto di non valutare soltanto il probando, ovvero la persona stessa che si rivolge, ma anche la famiglia, per cui si ricostruisce l'albero genealogico, chiedendo informazioni a partire dalla coppia per esempio su fratelli/sorelle, cugini, nonni ecc. Questo serve a capire se nella famiglia, oltre che nella persona stessa, c'è qualcosa che faccia sospettare un rischio per quella persona. In questo modo quindi capiamo i rischi e facciamo eventualmente testi genetici. Una volta appurato che quella coppia che aspetta un bambino ha un rischio maggiore della popolazione generale (infatti ricorda che tutti hanno un rischio di base), allora si parte con eventuali approfondimenti. Appunto, se c'è questo rischio si spiega quindi se è possibile fare analisi prenatale, e si aiuta la coppia in modo non dirigistico, ovvero non dobbiamo indirizzare verso aborto per esempio; infatti, ogni coppia vive la gravidanza come crede, e quindi dobbiamo solo supportare e spiegare i risultati aiutando le persone a seguire il percorso ma senza indirizzare.

Tecniche di indagine prenatale

Le tecniche che fanno parte di questo gruppo di indagini prenatali sono divisibili in due macrocategorie, ovvero tecniche invasive e non invasive. Con invasive si intende per esempio l'uso di un ago nell'addome della madre e che quindi hanno rischio di aborto; la prima differenza quindi tra tecniche invasive e no. Le non invasive sono essenzialmente ecografia, screening biochimici e NIPT, mentre le invasive sono prelievo di sangue fetale, amniocentesi e villocentesi.

Tecniche non invasive

• Ecografia: è un esame molto comune, è un sistema di indagine che usa ultrasuoni e l'aspetto positivo è che possiamo fare in ogni momento della gravidanza e non comporta rischi per il bambino. La regione Toscana è molto organizzata per le gravidanze e ha un protocollo, per cui ci sono una serie di esami organizzati in base alle settimane, secondo cui l'ecografia è prevista ogni trimestre, quindi 3 in totale, una al primo, una al secondo e terzo trimestre. L'uso e lo scopo ovviamente cambiano.
• La 1° ecografia, al termine del 3° mese, ci serve a capire se l'embrione è impiantato correttamente e quindi serve per capire una eventuale gravidanza extra-uterina, ma serve anche a capire se l'embrione c'è ancora; quindi, si vede vitalità e poi altra cosa importantissima è per capire quanti embrioni, in termini di numero, sono presenti. Infatti, il percorso delle gravidanze gemellari prevede un percorso diverso. L'altro aspetto è anche la datazione della gravidanza, infatti quando una donna ha un ritardo si chiede il giorno dell'ultima mestruazione e si inizia a fare un calcolo e solo l'ecografia poi ci dà indicazioni di quando è partita la gravidanza. E se per esempio più tardi il bambino non cresce è utile per capire se è perché la gravidanza è iniziata dopo o cose simili.
• Nel 2° trimestre ci serve invece a capire eventuali malformazioni; infatti, in Italia si può interrompere la gravidanza, ma lo possiamo fare per scelta personale nel 1° trimestre, mentre dopo il 1° lo possiamo scegliere soltanto in situazioni particolari e oltretutto c'è un limite proprio temporale, il massimo è durante la 22° settimana. Il momento dell'ecografia del 2° trimestre è quindi proprio il limite, per cui una malformazione in questo stadio la coppia può valutare l'interruzione. Serve per monitorare poi la crescita del bambino e anche per eventuali tecniche per amniocentesi e villocentesi per guidare l'andamento dell'ago nell'addome della madre.
• L'ecografia del 3° trimestre, intorno al 7/8 mese, serve a monitorare la crescita del feto; infatti, per esempio potrebbe crescere bene fino a metà gravidanza e poi avere anomalie, oppure serve a vedere malformazioni fino a questo momento non visibili. Sicuramente questo dipende dalle maggiori dimensioni e quindi maggiore visibilità, ma poi alcune malformazioni si creano nella crescita e per altro alcune malformazioni sono dovute a evoluzioni di parti che si formano più tardivamente durante la gravidanza. Serve poi a capire la localizzazione della placenta, soprattutto ai fini del parto, e poi serve a capire il liquido amniotico, importantissimo anche per la genetica; infatti, ci sono condizioni genetiche manifestabili, per esempio, molto banalmente con del liquido in più prodotto, che permette di creare sospetti.

Tecniche invasive

• Amniocentesi: è l'esame che è più frequentemente usato, perché si fa in molti ospedali e alcuni operatori non sanno fare la villocentesi ma sanno fare l'amniocentesi e quindi è la tecnica che ancora è più usata. Solitamente si fa tra la 16° e 18° settimana di gestazione e lo facciamo quando chiaramente possiamo programmarla, per cui sappiamo che ci sono motivi che ci giustificano di farla. Però potrebbe essere che dopo un'ecografia, per esempio alla 20° settimana, ci accorgiamo di una malformazione e si può fare anche in questo momento. Si preferisce però tra 16° e 18° settimana perché ci sono alcune analisi che necessitano di un tot di tempo e questo fa sì che altrimenti si abbiamo risultati oltre la 22° settimana che è il limite massimo per l'interruzione della gravidanza. Questa analisi consiste in un prelievo, in uno strumento che accoppia ecografia + ago con cui si preleva il liquido amniotico. Su di esso possiamo fare tantissimi esami, infatti contiene una parte ovviamente liquida e una corpuscolata rappresentata da cellule che sono quasi del tutto derivanti dalla desquamazione cutanea del bambino, ma anche cellule respiratorie dei primi tratti, ma anche dell'apparato urinario e cellule poi anche della membrana amniotica stessa. Quindi possiamo fare analisi biochimiche, cromosomiche, di agenti infettivi ecc.
• Infatti, se ci sono dei dati per cui la mamma ha avuto infezione in gravidanza, vediamo se nel liquido c'è l'agente patogeno e se si è verificato il passaggio placentare del patogeno indicando eventuale infezione anche nel bambino. Ma potendo estrarre il DNA da queste cellule possiamo chiaramente fare test genetici. Normalmente però se in una coppia entrambi sono portatori di fibrosi cistica e la coppia è interessata a fare analisi per vedere se il bambino ha la fibrosi cistica, si preferisce usare la villocentesi in generale. Abbiamo però detto che c'è un rischio di aborto dell'almeno 1%, ma dipende molto anche dal centro in cui si fa, se un centro ne fa 1 al mese c'è meno esperienza di quelli che ne fanno 40 al giorno. Di norma quindi si preleva il liquido amniotico, si prelevano delle provette, il campione viene messo quindi in coltura, isolando gli amniociti, perché altrimenti se si vede a microscopio il liquido non si vede niente e poi si ottiene l'analisi cromosomica. Se ovviamente dobbiamo accoppiare altre analisi, si fanno aliquote per inserire ciascuna su più analisi. Si usano di norma due metodi di coltura:
• Metodo in fiasca: ovvero in cui originano varie colonie e poi si ha triprinizzazione e analisi dei cromosomi, il problema è che si perde origine clonale e non si capisce se c'è una cellula danneggiata, da quale tipo cellulare derivi.
• Metodo in situ: in cui si fanno almeno 3 culture distinte ottenendo almeno 10 cloni totali, ottenendo almeno 1 "bella" mitosi per clone. Di fatto infatti è possibile che alcuni soggetti, in qualche tessuto, anche nel sangue, oltre a cellule normali, abbiano cellule patologiche, ovvero si parla di mosaico. Per esempio, la sindrome di Turner è la sindrome della monosomia X. Nella maggior parte delle donne, infatti, nell'età si perde un X, quindi se si fa analisi a una donna 80enne ci sta che alcune cellule siano XX e altre X. Questo è un caso fisiologico, ma può esserci anche in caso patologico. Questo, comunque, ci dice che accuratezza al 100% non ci sarà mai, ma dobbiamo fare in modo da analizzare la maggior quantità possibile di cellule del bambino, ed è impensabile che per esempio si prenda tutto il liquido amniotico, e ci sono indicazioni per cui è raccomandato cosa fare diciamo e appunto il metodo in situ ci permette di fare questo.
• Ovviamente, per quanto tutte queste fasi siano ben seguite, possono esserci problematiche, per esempio che le cellule non crescano e abbiamo fallimento di coltura; quindi, una donna fa una amniocentesi ma poi non si ha risposta alcuna, questo è per esempio uno dei rischi da spiegare in sede di consulenza. Oppure se non ci fosse completo fallimento, potrebbe esserci una scarsa crescita e la risposta la avremo solo dopo anche giorni. La risposta dell'amniocentesi viene fornita di solito dopo 15-18 giorni.
• Villocentesi, si esegue intorno alla 11° - 12° settimana. Anche qui, può succedere che se nella coppia alla 14° settimana compare rischio di sindrome di Down, invece di aspettare amniocentesi alla 16° settimana, possiamo fare una villocentesi anche se "tardiva" rispetto alle indicazioni. In questo caso si fa sempre un prelievo, ma di cellule placentari, questo perché le caratteristiche cromosomiche della placenta nella maggior parte dei casi corrispondono a quelle del bambino. Anche qui possiamo fare sempre le stesse analisi, tranne però la parte infettiva fattibile solo con amniocentesi. Anche in questo caso abbiamo rischio di aborto, che inizialmente fu molto discussa, pensando che fosse un rischio maggiore dell'amniocentesi, infatti in genere una gravidanza su 5 dà aborto fisiologico che avviene nel 1° trimestre, quando si fa la villocentesi appunto, ma forse il rischio maggiore era dovuto da una sovrapposizione con questo 20% di aborto naturale fisiologico. In mani esperte il rischio è paragonabile con amniocentesi. E è decaduto anche il pensiero che i bambini analizzati con villocentesi abbiano più rischio di malformazione, che in parte è vero ma solo se si fa prima della 9° settimana.
• In alcuni casi particolari invece accade che si consigli alla coppia di eseguire una coppia di villocentesi + amniocentesi; infatti, è il caso per esempio per cui il risultato della prima non è molto sicura e quindi per chiarire certi dubbi si richiede l'amniocentesi. Uguale si fa anche per esempio nel caso della gravidanza gemellare; infatti, solo in amniocentesi abbiamo due sacche amniotiche diverse mentre nel caso di villocentesi le placente sono molto vicine e unite e quindi è probabile che non si abbiamo ottimi risultati.

Nella villocentesi si fa il prelievo dei villi coriali, in particolare infatti intorno al 6° giorno si ha attacco di blastocisti nell'endometrio se la gravidanza è corretta e questo attacco all'inizio è stabile, ma poi si formano microvilli tra utero e blastocisti, dando solidità. Questo porta a sviluppo e attacco sulla parete interna dell'utero e il trofoblasto a contatto con endometri si trasforma in sincizio-trofoblasto che si inserisce nella parete materna. Si creano quindi delle strutture villari su cui appunto si fanno analisi di villocentesi. Si crea quindi una circolazione tra madre e bambino e la zona di contatto con l'endometrio si chiama decidua che è la parte materna e è bene sottolinearlo perché quando si fa il prelievo bisogna analizzare i villi fetali e non la decidua materna, sennò si analizza l'utero della madre ma non vogliamo. Si solito ogni aspirazione permette di prelevare 15-30 mg di vili e quanto ne prendiamo dipende molto da quante e quali analisi bisogna farci; infatti, 20mg sono ideali per citogenetica e basta, ma se bisogna accoppiare anche analisi molecolari o biochimiche sono necessari anche 30-40 mg.

• Una volta prelevato il campione a livello microscopico dobbiamo stare attenti che non ci sia del materiale materno; quindi, dobbiamo fare una pulizia e poi, dopo questo primo step, vengono fatte due tipologie di analisi, quando si fa analisi del cariotipo:
• Analisi diretta: si intende su cellule che già sono in divisione spontanea. Quindi si ha con incubazione per 24-48 h e si possono poi analizzare i cromosomi a microscopio.
• Metodo di coltura cellulare: in cellule in cui dobbiamo necessariamente fare una coltura cellulare. È una coltura che dura 5/7 giorni ma in base alla velocità arriva anche a più di 10 giorni.

Ovviamente l'analisi diretta ha il vantaggio del tempo, infatti si ottiene la risposta nel minor tempo possibile. Infatti, in genere l'analisi diretta nel totale dà risposta in 4 giorni, mentre l'esame colturale permette di dare risultati in 15-18 giorni.

Quando dobbiamo fare analisi di malattie monogeniche si preferisce sempre fare la villocentesi, che richiede appunto meno tempo dell'amniocentesi se fatta in analisi diretta, e poi spesso anche perché l'estrazione del DNA è più efficace farlo da villi coriali. Un altro motivo è per la scelta di interruzione di gravidanza, che infatti con villocentesi porta a pensarci dalla 11°-12° settimana, mentre con amniocentesi si fa solo alla 16° settimana.

Test rapidi prenatali

Esistono poi, oltre a amniocentesi e villocentesi, soprattutto per i rischi di aborto spontaneo, dei test che sono definiti test rapidi prenatali. Questi nascono quindi dal fatto che le aneuploidie, in particolari le classiche trisomie 21, 18 e 13, oltre alle anomalie del sesso, come X in più o meno, sono state messe in atto dei test proprio per concentrarci su queste tipologie di alterazioni. Anche perché la maggior parte degli embrioni con anomalia cromosomica porta ad aborto spontaneo in età molto precoce, non permette nemmeno di arrivare alla villocentesi, alla 11° settimana. Di fatto di quel 20% di aborti spontanei fisiologici che avvengono in 1 donna su 5, avvengono proprio per anomalie cromosomiche spontanee non compatibili con la vita. I test rapidi che possiamo fare oggi si dividono in tre test:

• FISH: ovvero la Fluorescence in Situ Hybridization, che si basa sull'uso di sonde specifiche per alcuni cromosomi, in questo caso, nei test rapidi prenatali, sono sempre 21, 13, 18, X e Y. La tecnica si basa su fluorescenza e se il segnale è presente per esempio 3 volte...