Genetica medica

Genetica medica: cariotipo umano

Lezione 1 prof.ssa Finelli

Citogenetica mediante microscopio ottico, studia la morfologia e il numero dei cromosomi, e il loro ruolo nell’ereditarietà. Inizialmente usata per il mappaggio dei geni sui cromosomi, oggi è utile in diagnostica e in ricerca per evidenziare anomalie del cariotipo.

L’analisi dei cromosomi permette di ricostruire l’insieme dei cromosomi di una cellula in un individuo. → Cariotipo

I cromosomi sono visibili solo nelle cellule in attiva proliferazione.

Lo studio del cariotipo è utile e importante in medicina perché:

• Circa 1/200 dei neonati ha una patologia cromosomica.
• Più del 50% degli aborti spontanei è causato da anomalie cromosomiche, rilevato nel tessuto abortivo.
• Un 1/100 è portatore di un’anomalia bilanciata che può essere associata a infertilità/abortività e aumentato rischio di avere figli con patologie cromosomiche.
• La maggior parte dei tumori ha anomalie cromosomiche multiple, alcune specifiche, associate direttamente all’inizio della tumorigenesi, altre rappresentano solo l’acquisizione da parte delle cellule di instabilità genomica e cromosomica che determina un accumulo di anomalie cromosomiche nei tessuti tumorali.

Cromosomi omologhi

Cromosomi omologhi, organismi diploidi: sono i membri di una coppia di cromosomi, uno di derivazione paterna, l’altro materna, sono uguali per dimensione, forma e posizione dei loro centromeri.

I cromosomi omologhi portano l’informazione per il controllo degli stessi tipi di caratteristiche genetiche, sebbene non necessariamente l’identica informazione.

Es.: I membri di una coppia di cromosomi omologhi potrebbero portare ognuno un gene che specifica per la struttura dell’emoglobina ß, tuttavia uno potrebbe avere l’informazione per l’emoglobina normale e l’altro potrebbe specificare per una forma anomala di emoglobina associata all’anemia falciforme.

• Contengono DNA che codifica per le stesse proteine.
• Hanno gli stessi geni nella medesima posizione, ma possono presentare varianti diverse, alleli.

I cromatidi fratelli sono delle repliche esatte mentre i cromosomi omologhi no.

I due bastoncelli del cromosoma, osservabili al microscopio ottico, sono due molecole lineari identiche di DNA che vanno incontro ad una compattazione → nucleosomi, ottamero formato da proteine istoniche, fibra da 10 nm → fibra da 30 nm → avvolgimento e loops → 600 nm fino a raggiungere il livello massimo durante la metafase, stadio che precede la separazione dei cromatidi in anafase, facilita il trasporto del materiale genetico per una corretta segregazione.

Durante il ciclo cellulare il contenuto del DNA cambia: 2C → fase S → 4C, ma il n° di cromosomi non varia, 46. È formato da un solo cromatidio = cromosoma o, dopo la fase S, finita la replicazione del DNA, due cromatidi legati nella regione centromerica = cromosoma.

Struttura del cromosoma

• Il centromero, grazie alla formazione del cinetocore, un complesso proteico attraverso il quale i cromosomi si legano al fuso mitotico permettendo la loro separazione durante l’anafase, è importante per mantenere i due cromatidi uniti fino all’inizio dell’anafase e per una corretta segregazione dei cromatidi durante la divisione cellulare tramite i microtubuli. NB.: il cinetocore è duplice, uno per ciascun cromatidio.
• I telomeri sono strutture estreme di ciascun cromosoma, presentano una sequenza ripetuta riconosciuta dalla riboproteina telomerasi in grado di appaiarsi e allungare il filamento che tende ad accorciarsi durante la replicazione. Ai telomeri, formati da eterocromatina, si legano proteine che proteggono l’estremità dei cromosomi in modo che non si leghino ad altri cromosomi e formino strutture aberranti.

I cromosomi sono strutture che occupano dei territori specifici all’interno del nucleo e molti interagiscono tramite i telomeri con la membrana interna nucleare.

Braccio corto, p = petit, e lungo, q = queque: il centromero, cioè la costrizione primaria, divide il chr in due regioni.

Storia della citogenetica

Epoca del pre-bandeggio cromosomico:

• Già nel XIX secolo si ebbero le prime immagini dei cromosomi umani.
• 1950: 48 cromosomi.
• 1952: Introduzione soluzione ipotonica, T.C. Hsu: 48 cromosomi. Non si sapeva il numero, era diverso, usavano cellule tumorali ad esempio. 48? Numero del più vicino antenato scimpanzé.
• Solo nel 1956 grazie a Tjio si stabilì come 46 il numero del corredo cromosomico corretto umano aprendo la strada all’individuazione della causa di alcune patologie associate ad aneuploidie di specifici cromosomi.
• 1959: Lejeune, un pediatra genetista, pubblica un lavoro dove osservava nei bambini con Sindrome di Down un extra cromosoma → individuazione della causa di alcune patologie associate ad aneuploidie di specifici cromosomi.
• 1960: si osservò il cromosoma Philadelphia nelle cellule di pazienti con la leucemia mieloide cronica → prima documentazione della causa genetica della tumorigenesi.
• 1960: Conferenza di Denver “A Proposed Standard System of Nomenclature of Human Mitotic Chromosomes”. Divisione in gruppi, dal più grande al più piccolo dei cromosomi.

Epoca bandeggio cromosomico:

• Agli inizi del 1970 si misero a punto tecniche di bandeggio che permisero di identificare in modo inequivocabile i diversi cromosomi. L’aumentata risoluzione delle tecniche citogenetiche permise di capire che il cromosoma Ph, filadelfia, non era determinato da una delezione del cromosoma 22 ma da una traslocazione reciproca tra i cromosomi 22 e 9.
• 1971, Caspersson mise a punto una tecnica che utilizzava una mostarda di Quinacrina, sostanza fluorescente, che evidenziava le bande Q sui cromosomi → possibile identificare riarrangiamenti strutturali.
• 1972, tecnica che evidenzia le bande G con tripsina-Giemsa.

La tripsina è un proteolitico, il Giemsa determina il bandeggio perché colora. Le regioni più scure sono quelle meno compattate perché la tripsina agisce meno.

Le bande scure, più colorate, rappresentano regioni ricche in AT.

NB.: In parte sovrapponibile al bandeggio Q.

Studio dei cromosomi umani: analisi del cariotipo

NB.: Non tutte le cellule possono essere usate per l’analisi del cariotipo: si guarda il recupero, l’invasività e il quesito diagnostico.

1. Allestimento della coltura

Lo studio dei cromosomi si effettua su cellule proliferanti bloccate in metafase.

Fonti di cellule in divisione: sangue periferico, solitamente il più semplice da recuperare e non invasivo, midollo osseo, colture da tessuti solidi, fibroblasti, linfonodi, tumori solidi, colture da tessuti abortivi, liquido amniotico, villi coriali, sangue fetale, linee cellulari immortalizzate.

Le colture sono effettuate sotto cappa, in ambiente sterilizzato.

Il sangue solitamente arriva in presenza di anticoagulanti come l’eparina.

Il terreno di coltura deve contenere:

• Soluzioni saline isotoniche, amminoacidi, vitamine, nucleotidi, un indicatore di pH.
• È importante aggiungere dei sieri: prima siero fetale di bovino, oggi “artificiali” contenenti i componenti fondamentali per la crescita cellulare come proteine, fattori di crescita, zuccheri.
• A volte è necessario aggiungere una sostanza in grado di stimolare la crescita cellulare = mitogeni, per sangue PHA: mucoproteina dei linfociti T; LPS e conA per crescita dei linfociti B midollo dipendenti.
• Alla fine della crescita cellulare si aggiunge uno tra colchicina, impedisce la polimerizzazione della tubulina, vinblastina, farmaci che inibiscono il fuso mitotico, bloccano le cellule durante la metafase.

Le cellule si pongono in una stufa a CO2 nelle flask e si aspettano almeno 48h, fino a 72-96h. I linfociti hanno ciclo cellulare di circa 24h, lo scopo è avere una quantità di cellule sufficienti.

Circa 30 min o 1h prima della fine si aggiunge la colchicina.

La soluzione ipotonica, dove poi viene risospeso il pellet, permette alle cellule di rigonfiarsi in modo da rendere i cromosomi ben visibili, analizzabili.

Dopo 20-30 min a 37°C, si ricentrifuga e si lava con un fissativo per 2/3 volte, con acido acetico e metanolo in proporzione 3:1.

Questo per quanto riguarda il sangue, l’analisi si può fare anche su altre cellule come i fibroblasti, prelievo più invasivo, necessario staccarli dalla flask per poi metterli in sospensione per l’analisi.

2. Preparazione dei vetrini

Le cellule, risospese in una quantità opportuna di fissativo fresco, vengono fatte cadere mediante sgocciolamento, 2-3 gocce, su vetrini pretrattati, miscela di alcol assoluto e HCL, posti in acqua distillata.

Per una buona qualità dei preparati, l’umidità e la temperatura dell’ambiente devono essere controllate: le condizioni migliori sono offerte da 20°C con una umidità relativa di poco superiore al 50%.

Dopo rottura della membrana, il fissativo evapora e viene perso anche il citoplasma.

3. Bandeggio G, Q, R: colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine

I cromosomi vengono classificati in base alla loro dimensione e in base alla posizione del centromero.

In base alla posizione del centromero i cromosomi si distinguono in: (…) metacentrici, 1,3,19,20, submetacentrici e acrocentrici, 13,14,15,21,22. Il braccio corto è molto piccolo e contiene solo sequenze ripetute, eterocromatica, formato da DNA satellite, ripetizioni in tandem che codifica per rRNA.

Sebbene la posizione del centromero e la lunghezza relativa dei due bracci aiutino l’identificazione di specifiche coppie di cromosomi, alcuni o molte coppie di cromosomi sembrano identiche utilizzando solo questo criterio.

Bande G

Trattamento con Tripsina, colorazione con Giemsa. Bande scure ricche in AT, 2 legami.

Prodotto dalla colorazione con Giemsa dopo digestione enzimatica con tripsina.

• Bande scure, bande G, replicano tardivamente, cromatina più condensata, ricche in AT.
• Bande chiare-G-negative, replicano precocemente, cromatina meno condensata, ricche in GC.

Bande Q

Colorazione con Quinacrina, colorante fluorescente che non si lega preferenzialmente alle zone ricche in AT. Nelle regioni ricche in AT la fluorescenza è più stabile e quindi più “luminosa” perché decade più lentamente.

• Bande fluorescenti = ricche in AT.
• Bande spente = ricche in GC.

Bande R

Denaturazione al colore in soluzione salina, poi colorazione con Giemsa. Denaturazione delle zone ricche in A e T, quindi si ottiene un pattern di bandeggio “reverse” rispetto al bandeggio G.

2 tipi:

• RHG, R-banding by heat using Giemsa. Denaturazione con il calore, 85°C, delle proteine e DNA AT-rich, mentre restano nella forma nativa le regioni GC-rich riconosciute da questo bandeggio attraverso la colorazione con Giemsa.
• RBA, R-banding by BrdU using Acridine Orange.

Nel RHG:

• Bande scure = ricche in GC.
• Bande chiare = ricche in AT perché il trattamento con il calore denatura il DNA ricco in AT.

Il bandeggio RBA si ottiene aggiungendo in coltura nella fase tardiva S del BrdU, Bromodiossiuridina, con incorporazione dello stesso solo nel DNA che si replica tardivamente, X inattiva.

I cromosomi ottenuti vengono colorati con Arancio di Acridina.

• Bande fluorescenti = ricche in GC.
• Bande poco fluorescenti, più spente, = ricche in AT, incorporazione di BrdU e X inattivo, replica tardivamente.

Ognuna di queste tecniche produce un pattern di bande chiare e scure, fluorescenti e non, lungo l’intero cromosoma.

Ogni coppia di cromosomi mostra un unico pattern di bandeggio, analogo ad un “bar code” che ci permette di differenziare l’uno dall’altro cromosomi con stessa taglia e stessa posizione del centromero.

Bande C

Denaturazione in soluzione satura di idrossido di bario, poi colorazione con Giemsa. Mettono in evidenza l’eterocromatina costitutiva.

Colorazione di regioni di eterocromatina costitutiva.

Uno dei bandeggi particolari in grado di evidenziare alcune regioni cromosomiche ma non consente la composizione del cariotipo.

Non permette di distinguere i diversi cromosomi.

Può essere usato quando, effettuando un cariotipo in epoca pre-natale, si identifica un marcatore sovrannumerario di origine cromosomica ignota → non si conosce l’effetto sul fenotipo.

Il bandeggio C può far capire se il feto può essere affetto da un’anomalia cromosomica.

Esistono altri bandeggi usati come test diagnostici in caso si sospetti una condizione caratterizzata da un aumentato scambio di materiale tra cromatidi fratelli.

Quando la BrdU è presente per due interi cicli cellulari, un cromatide conterrà una sola catena polinucleotidica con la incorporazione, mentre l’altra avrà incorporato su entrambe le catene.

4. Osservazione al microscopio, selezione delle metafasi, acquisizione delle immagini e ricostruzione del cariotipo

• Si contano i cromosomi: importante per escludere la presenza di alterazioni nel numero cromosomico.
• Si appaiano gli omologhi per similarità.
• Si mettono in ordine secondo la convenzione.

46, XX - cariotipo normale femminile. 46, XY - cariotipo normale maschile.

Cariotipo: questo modo di scrivere ci dà due informazioni: numero totale dei cromosomi, 46, sesso dell’organismo.

I cromosomi si identificano da tecniche di colorazione specifiche.

Ci sono delle linee guida ISCN, International System for Human Cytogenetic Nomenclature, che indicano come descrivere le anomalie che si trovano nel cariotipo.

• Ogni cromosoma è diviso dal centromero, il braccio corto e lungo.
• Ogni braccio è suddiviso in regioni. Ogni regione è numerata a partire dalla regione più vicina al centromero, prossimale, a quella più lontana, distale.
• Ad ogni regione corrispondono delle bande, sempre numerate partendo dalle più vicine al centromero.

Es.: 18 p21, due uno non 21: due = regione, uno = banda.

Il numero di bande può cambiare in base alla diversa risoluzione, cariotipo std di 400 bande solitamente.

Il bandeggio è effettuato su cromosomi prometafasici, permette di aumentare la risoluzione → si possono ottenere fino a 850 bande.

Limite di risoluzione dei bandeggi 5-10Mb.

• I bandeggi cromosomici con risoluzione differente permettono di individuare bande, sotto-bande e sotto-sotto-bande.

I cromosomi vengono divisi in regioni che vengono indicate con p1, p2 ecc. e q1, q2 ecc… a partire dal centromero verso il telomero.

Le regioni vengono poi divise come bande p11, p12… e sotto-bande p11.1, p11.2 e sotto-sotto-bande p11.21, p11.22…

NB.: è possibile che nella popolazione generale ci siano differenze nel numero di copie ripetute nei cromosomi acrocentrici → danno luogo ai polimorfismi cromosomici.

Polimorfismi cromosomici

Polimorfismi eterocromatici:

• Variazioni dell’eterocromatina pericentromerica: i più frequenti coinvolgono i cromosomi 1, 9 e 16.
• Per esempio, l’estensione dell’eterocromatina pericentromerica del 9, 9qh+, è presente nel 8% della popolazione; l’inversione della stessa regione, inv9qh, si ritrova con una frequenza del 1,5%.
• Variazione di grandezza del braccio lungo del cromosoma Y.
• Variazione dei satelliti dei cromosomi acrocentrici.

Polimorfismi eucromatici:

• Siti fragili: specifica regione cromosomica che appare come un intervallo non colorato, gap, o come una franca rottura sul cromosoma metafasico.
• Non è detto che correli con una condizione patologica.

Anomalie cromosomiche

Lezione 2

Le anomalie cromosomiche sono mutazioni che producono un’alterazione cromosomica.

Possono essere suddivise in anomalie di numero e anomalie di struttura.

Entrambe queste anomalie possono essere inoltre suddivise in anomalie costitutive, se presente alla nascita, oppure anomalie somatiche o acquisite, se acquisita in un secondo momento es. cancro.

Non tutte le alterazioni cromosomiche possono essere identificate perché esiste un limite di risoluzione della citogenetica standard pari a 5-10 Mb.

Le anomalie di struttura si distinguono in:

• Bilanciate → nella maggioranza dei casi non sono correlate ad un fenotipo anomalo, a meno che non ci sia l’interruzione di un gene sensibile al dosaggio o mutato sull’altro cromosoma. Nonostante il numero dei cromosomi può cambiare, tutti i “pezzi” sono presenti → non c’è né perdita né acquisizione di materiale.
• Sbilanciate → sono correlate ad un fenotipo anomalo, malformazioni multiple e congenite e/o disabilità intellettiva.

Sono presenti 2 cromosomi 21 nell’immagine, trisomia presente nel 4% dei pazienti con Sindrome di Down.

La gravità è correlata al tipo di cromosoma e alla quantità di geni interessati.

In linea generale, tanto più è grave lo sbilanciamento cromosomico, tanto più grave sarà il fenotipo o più precoce l’aborto spontaneo.

In realtà è necessario tenere conto dei geni presenti nel segmento, alta densità genica o un solo gene molto importante…, coinvolto.

Le anomalie cromosomiche rappresentano la patologia più frequente del concepimento e, nonostante la fortissima selezione naturale mediante l’aborto spontaneo, la loro frequenza alla nascita è elevata.

Anomalie cromosomiche di numero

• Euploidia: un esatto multiplo del numero cromosomico aploide, n, è definito euploide. Le normali cellule somatiche con 46 cromosomi sono cellule euploidi.
• La poliploidia è la costituzione cromosomica di una cellula, o di un organismo, che possiede tre o più assetti cromosomici n.
• Poliploidi: → Triploidi contengono un set co