Genetica Molecolare dello sviluppo

Forward genetics e reverse genetics

Forward Genetics: come ha luogo un processo, andandolo ad alterare attraverso mutazione. Eseguendo una mutagenesi è possibile identificare il gene o i geni mutati e stabilire in che relazione sono tra di loro e la loro funzione nella formazione del tessuto di interesse.

Reverse Genetics: attraverso il clonaggio è possibile inserire una mutazione in un cDNA, eseguire una mutagenesi pianificata dallo sperimentatore (invece di creare un organismo mutato e poi dover verificare quali sono i geni mutati). È possibile ottenere organismi transgenici. Si parte dal gene per arrivare al processo biologico. Si fa il contrario della forward genetics.

Sviluppo e genetica dello sviluppo

Con il termine sviluppo si intendono tutti quei meccanismi secondo cui da uno zigote si forma un organismo pluricellulare.

Una delle domande principali della Genetica dello Sviluppo: una cellula differenziata ha un genoma che ha perso l'informazione per "fare" altri tipi di cellule oppure il genoma è ancora lì ma è attivo solo quello per fare un determinato tipo di cellula?

I primi studi

• T. Boveri: studia il riccio di mare, abbiamo le prime due divisioni che avvengono su piano ortogonale e il terzo è perpendicolare, formano otto blastomeri. Analizza la polispermia che, a causa della fusione di due nuclei provenienti da due spermatozoi con quelli di un ovocita, crea delle aberrazioni che portano alla formazione di quattro fusi mitotici e alla conseguente formazione di cellule aneuploidi. Boveri induce la polispermia e separa i quattro blastomeri attraverso un filo sottile e osserva lo sviluppo di ciascun blastomero. Quello che vede è che ciascun blastomero si sviluppa in modo diverso. Quindi ogni blastomero aveva un contenuto informazionale diverso.
• Spermann: eseguendo una costrizione, separa la blastula in modo tale che il nucleo dello zigote si trovasse solo da un lato: così si aveva un embrione con 16 cellule. Allentando quella costrizione faceva migrare un nucleo dall'altra parte e vedeva che entrambi davano origine a due funzionanti. Dimostra che fino a 16 cellule è in grado di avere la stessa potenzialità che aveva lo zigote.
• Wilson & Stevens: dimostrano l'importanza del cromosoma, correlando la caratteristica fisica a una composizione del genoma.

Una cellula differenziata ha le stesse potenzialità dello zigote da cui proviene, quindi il suo nucleo dovrebbe essere in grado di generare ogni altro tipo di cellula differenziata (se messo in una cellula ancora indifferenziata). Cioè dovrebbe contenere tutte le informazioni necessarie.

Come fanno a dimostrarlo? I primi esperimenti risalgono agli anni 50.

• Pungono con un ago l'ovocita della rana, quando lo fanno, il fuso degli ovociti bloccati in meiosi cambia posizione per riarrangiamento (si sposta verso il basso dell'ovocita) e così è facile da rimuovere. Inoltre la puntura permette di attivare gli ovociti. Dopodiché dissolvono tessuti delle cellule differenziate e ne prelevano il nucleo e ne trapiantano uno nuovo di spermatocita e uno nuovo di ovocita. E ottengono zigoti che si sviluppano in girini. All'inizio usano solo il nucleo di un blastomero. Questo però non sono pienamente differenziati. Per cui rifanno esperimenti con cellule via via più differenziate: cellule di blastula tardiva, cellula precoce e tardiva di gastrula, coda di girino. E si è visto che man mano che queste cellule erano più sviluppate, si aveva via via una diminuzione delle cellule differenziate. Questa conclusione si è rivelata incorretta.

Gurdon: cambia il sistema modello usando lo Xenopus che raggiunge prima la fertilità sessuale, l'ovogenesi può essere facilmente indotta in qualsiasi momento. Un problema di Xenopus è che ha un involucro esterno. Usa, per enucleare, i raggi UV per distruggere il nucleo e anche per eliminare l'involucro. Inoltre usa marcatori genetici per dimostrare che l'individuo è derivato da un trapianto nucleare.

L'utilizzo di un marcatore genetico consente di, seguendo la manifestazione fenotipica del marcatore, dire che l'individuo è derivato da trapianto nucleare. Si usa continuamente per gli organismi transgenici. Usa una marcatura (1-m) che è un marcatore per la delezione dei geni ribosomiali 18s e 28s; caratterizzati da un nucleolo invece che due (wt). Si usa il donatore, il mutato-1 nucleolo, ottenuto da una neurula in un ovocita nucleolo wt. Dovrei così osservare un organismo con un solo nucleolo, e così è. L'altro marcatore eclatante era usare un nucleolo donatore da un organismo di Xenopus albino. E si vede che tutta la progenie era albina.

Anche lui ha usato come nuclei donatori cellule che via via erano più differenziate, e si vede che mano mano che le cellule si differenziavano, i nuclei delle cellule donatrici.

Esperimenti di Gurdon

Gurdon nel '66 dimostra che ha usato come cellule donatrici cellule differenziate:

• Intestino del girino che si nutre: perché se il girino si nutre, le cellule dell'intestino sono differenziate e vede che riusciva nel suo esperimento e l'1% dava individui adulti.
• In questi risultati, in parallelo, otteneva anche degli "embrioni parziali" dovuti a degenerazione, ma una parte di essi si sviluppa. Fa dei trapianti seriali: usa l'embrione parziale e fa un secondo trapianto in un ovocita enucleato, ottenendo degli embrioni completi e un individuo morto. L'ipotesi è che manca sincronia tra prima divisione e seconda divisione dello zigote, una cellula quindi sarà una viva e l'altra morta.

Il differenziamento, dunque, non comporta una perdita di informazione genica. Ma si trova in una forma silente: se metto nell'ambiente giusto, il genoma può essere riprogrammato.

Le critiche

• Rispetto allo stadio: visto che allo stadio del girino adulto le cellule della linea germinale devono ancora migrare verso le gonadi. Quindi avrebbe potuto prelevare quelle, quindi ancora parzialmente indifferenziate.
• L'altro riguarda le cellule dell'intestino: potevano ancora essere non del tutto differenziate, perché in quelle cellule, a quello stadio, c'è ancora del vitello.

In successivi lavori ha usato cellule provenienti da adulti in cui otteneva girini ma non andava oltre. Ha usato i cheratinociti delle membrane inter-epiteliali, polmone e cuore.

Clonaggio

Campbell ha ottenuto delle pecore adulte, usando nuclei da una linea cellulare embrionale. Poi hanno utilizzato cellule embrionali (9 days), cellule di feto (26 days), ghiandole mammarie adulte (6 anni). Quindi era possibile ottenere un nucleo donatore che portava a un adulto formato.

Usano due razze diverse di pecora. Viene indotta l'enucleazione e l'ovocita viene enucleato tramite aspirazione, poi veniva preso il nucleo, messo in coltura e poi inserito nell'ovocita enucleato; viene attivato l'uovo attraverso stimoli elettrici che permettono la destabilizzazione della membrana e le cellule si fondono insieme e quando l'ovocita diventa blastula viene reimpiantato nella pecora, madre surrogata. Una di essa ha dato origine alla pecora Dolly, con caratteristiche della razza donatrice del nucleo.

Si è usato:

• Epitelio mammario: 1 offspring (Dolly).
• Fibroblasti fetali: 1 muore e 1 vive con fenotipo della razza donatrice.
• Embrioni: 4 offspring, 2 nate con Cesareo.

Hanno usato l'analisi degli SNP mediante microsatelliti per eseguire la genotipizzazione. Il genotipo deve essere uguale al donatore e diverso dall'accettore. L'analisi dimostra ciò.

La riuscita del clonaggio dipende dalla specie e dalla tecnica usata. È possibile fare una correlazione tra successo del clonaggio quando quello che riceve non è uno zigote enucleato ma un ovocita. Visto che il nucleo viene riprogrammato, esso viene riprogrammato in maniera più efficiente quando è un ovocita piuttosto che uno zigote.

Per quanto riguarda la cellula donatrice, la percentuale di successo dipende dallo stato delle cellule donatrici, la percentuale di successo dipende dallo stato delle cellule donatrici, è maggiore quando le cellule sono in fase G0, G1 o M. Questo sarebbe dovuto al fatto che deve avvenire una riprogrammazione del nucleo, quindi le modificazioni epigenetiche avverrebbero in modo migliore negli stadi di quiescenza, riorganizzazione della cromatina. Mentre in fase M o G1 la cromatina potrebbe essere più facilmente accessibile per la riprogrammazione.

Non tutte le stesse caratteristiche possono essere clonate. Per esempio l'inattivazione del cromosoma X, per cui tutte le caratteristiche associate a esse sono casuali e non clonabili.

Sindrome di clonaggio

Possiamo avere elevati tassi di mortalità prenatale, gestazione prolungata, variazioni di peso alla nascita, maggiore rispetto alla media. Potremmo avere fenotipi patologici: quale elevata mortalità, obesità, sistema immunitario compromesso, riduzione della durata di vita.

Eteroplasmia: ci sono due DNA, nucleare e mitocondriale.

Espressione genica differenziale

Come può accadere che da uno zigote si formi un organismo pluricellulare?

Negli anni '60 è stata espressa la teoria dell'espressione genica differenziale:

• Ciascuna cellula ha lo stesso genoma, tranne i linfociti B e T.
• I geni non espressi più, mantengono la capacità di essere espressi, ma non la usano.
• Una piccola percentuale del genoma è espressa in ogni tipo di cellula.

Ibridazione in situ

Ibridazione in situ: con digossigenina (GIN: è uno steroide che si lega a UTP per poterlo marcare), ci permette di comprendere i territori spaziali in cui un gene è espresso.

Possiamo fare entrare questa sonda nel tessuto; per far appaiare RNA o formare ibridi DNA-RNA. Dopo il riconoscimento si forma un DS che contiene GIN e vengono legati da anticorpi coniugati a perossidasi o fosfatasi alcalina.

Possiamo usare marcature diverse, usando anche apteni fluorescenti, usiamo un anticorpo secondario servendosi di un fluorocromo.

Si può usare la GIN per localizzare anche i cromosomi e vedere su di essi uno specifico gene.

Immunostaining

Immunostaining: possiamo vedere la localizzazione di proteine, dobbiamo avere un anticorpo diretto contro la proteina di interesse e non una sonda, riconosciuta poi da un anticorpo secondario coniugato ad un enzima o fluorocromo. Oppure un anticorpo primario già marcato.

Differenziamento

Commitment: la cellula ha acquisito il destino, anche se esteriormente non si differenzia, ma è stata preordinata.

C'è un momento della specificazione: che è una fase reversibile, dipende dall'ambiente.

Determinazione: è irreversibile.

Dopodiché c'è il commitment.

È specificata se viene privata del suo contesto e posta in un ambiente neutro, si può sviluppare come se fosse nella sua cellula di provenienza. Ma se messa in un ambiente diverso, può cambiare destino.

È determinata se messa in un nuovo ambiente non cambia.

La specificazione può essere:

• Autonoma: ogni cellula si sviluppa anche separata dall'altra, non sono in grado di autoregolarsi. Ad esempio le cellule dei trofoblasti. Prelevando un particolare blastomero questo predice gli stessi tipi di cellule che avrebbero prodotto se avessero ancora fatto parte dell'embrione.
• Conduzione regolativa: una cellula può seguire, quindi viene specificata verso multipli destini differenziativi. È in grado di modulare il proprio destino. Per esempio enucleazione. Se si prelevano delle cellule della regione dorsale del girino, e si pongono nella regione ventrale, cambiano il loro destino. Oppure se si sposta una regione della blastula, le cellule sono in grado di compensare autoregolandosi. Esempio ne è quello dei gemelli.
• Sinciziale: molto diffusa negli insetti, ha luogo all'interno di un territorio unico caratterizzato da morfogeni che danno istruzione ai nuclei delle varie cellule in base alla loro posizione, dando origine a una specifica porzione. Quindi al contrario della precedente, l'influenza è data dal citoplasma e non dalle cellule circostanti.

Organismi modello e i loro scopi

• Primo esempio storico è il Pisum sativum.
• Permette di studiare delle caratteristiche che noi consideriamo universali.
• S. cerevisiae: organismo modello per i primi studi sugli eucarioti, in particolare per la regolazione del ciclo cellulare. Consente di fare studi di genetica classica ma anche di genetica inversa, grazie all'elevata frequenza di ricombinazione omologa.
• C. elegans: usato per gli studi di RNAi, è composto da un numero fisso di cellule, 959 e 302 neuroni.
• X. laevis.
• Zebrafish.
• Mus musculus.
• Arabidopsis thaliana.
• Drosophila: ha una lunga storia di ricerche genetiche, si presta all'analisi di molti meccanismi biologici. In particolare nei meccanismi di segnalazione cellulare. È un ottimo sistema modello per lo studio di malattie umane, questo perché moltissimi geni associati a patologie umane hanno un omologo in Drosophila. Addirittura è stato usato negli studi della dipendenza d'alcol.

Cy (Curly) è un esempio di mutazione di Drosophila, groucho presenta sugli occhi delle setole addizionali.

• La Drosophila ha 3 stadi larvali, poi c'è lo stadio di pre-pupa, pupa, a 25° dura 4-5 giorni, e poi diviene adulto che prima di raggiungere la maturità sessuale deve aspettare 3/4 ore.
• Ci sono evidenti differenze fenotipiche, la Drosophila F è più grande, ma solo il M ha l'organo copulatore e delle setole sulle zampe coinvolte nel rituale dell'accoppiamento.
• Nei maschi è completamente assente la ricombinazione omologa, questo è un aspetto molto rilevante. Qualsiasi assortimento dei geni viene mantenuto come tale. Ha 4 cromosomi, con un cromosoma sessuale, due cromosomi metacentrici e un primo cromosoma piccolo eterocromatico. Il genoma è circa di 180 Mb, 120 eucromatina, 80 eucromatina. Ci sono dei polimorfismi nelle regioni eterocromatiche del cromosoma Y. Il cromosoma Y è quasi del tutto eterocromatico. Ci sono dei cromosomi che sono politenici, cromosomi giganti.

Drosophila e cromosomi politenici

• Cromosomi politenici: nella regione delle ghiandole salivari.
• I cromosomi politenici sono visibili anche a basso ingrandimento, è possibile distinguere regioni eterocromatiche, poco intense, rispetto a quelle eucromatiche, che si colorano molto più debolmente. Questo ci darà un bandeggio molto specifico e riproducibile sui cromosomi, che ci darà una mappa citologica sui cromosomi; consente di identificare univocamente i diversi cromosomi. Tutte le braccia dei politeni sono unite nel cromocentro, che è una regione eterocromatica. Questi vengono isolati tramite lisi delle ghiandole salivari, squash.
• Questi si formano perché avvengono molte divisioni del DNA ma senza divisioni. Quindi abbiamo un cromosoma composto da moltissimi filamenti che restano appaiati, si avrà un contenuto di DNA di 1024C. Questi cromosomi sono trascrizionalmente attivi, questi cromosomi organizzati in questo modo le cellule hanno un'elevata attività metabolica durante la crescita, forniscono quindi un vantaggio essenzialmente metabolico e quindi questo bandeggio è riproducibile per ciascun cromosoma. Questo bandeggio è utilissimo al fine di localizzare la localizzazione del genoma in specifici geni. Uno degli approcci per identificare posizioni specifiche di regione del DNA è stato quello di osservare cromosomi politenici, al fine di stabilire l'estensione di delezioni. Per poter mappare delle delezioni e quindi comprendere i geni coinvolti nella delezione, si fa un'analisi dei cromosomi politenici eterozigoti, uno wt e uno che porta una delezione. Quindi quando un omologo porta una delezione e uno è wt, si forma un loop, dovuto al mismatch di appaiamento tra cromosomi omologhi.
• L'altro utilizzo molto importante è rappresentato da un'analisi in cui è stato utilizzato il fenomeno della pseudo-dominanza. Se abbiamo un individuo che è eterozigote. Cioè se ho un organismo che ha un allele wt C deleto e un allele mutato recessivo c, allora avrò un fenotipo ABcD che è pseudo dominante, perché se C grande non fosse stato deleto, avrei avuto ABCD e quindi wt. Se si verifica la pseudodominanza, allora sono riuscito a identificare l'intervallo citologico in cui quel gene è localizzato. Anche sui cromosomi politenici è possibile fare un'ibridazione in situ e tecniche di immunostaining, ci dice se la proteina è in grado di legarsi al DNA e dove, e anche se due proteine sono in grado di legarsi alla stessa regione, co-immunostaining.
• Essendo la Drosophila un moscerino piuttosto grande, è possibile seguire molte delle caratteristiche morfologiche, complesse, della Drosophila e che sono associate a specifici genotipi. Ci permette di seguire la mutazione da una generazione a un'altra e consente di seguire gli eterozigoti dagli omozigoti e permette di capire quali individui portano più mutazioni.

Forward genetics

La mutazione resta un evento casuale, la cui incidenza è molto bassa, è difficile predire dove e quando la mutazione si verificherà. La mutagenesi invece aumenta il tasso con cui una mutazione si possa verificare. Se sottoponiamo un animale a un mutageno, la mutazione può colpire la linea somatica o quella germinale, che possono essere ereditate.

Mutazione condizionale: l'effetto del fenotipo si verifica solo in determinate condizioni, che sono definite condizioni restrittive. In altre occasioni, dette permissive, non si osserva alcun fenotipo.

Ad esempio la mutazione può essere temperatura sensibile.

Possiamo usare mutageni: chimici, fisici e biologici.

Un mutageno noto è l'EMS (ethyl-methane-sulfonate), è un agente alchilante che va ad aggiungere gruppi etilici all'ossigeno 6 della guanina o all'azoto 7 della guanina oppure all'ossigeno 4 della timina. Quello che