Genetica medica

Genetica medica: citogenetica e analisi del cariotipo

Studio dei cromosomi, molecole di DNA assemblate con proteine istoniche e non istoniche.

Diverse patologie in cui è implicato riarrangiamento cromosomico.

Cariotipo

Insieme di cromosomi, certo numero e certa morfologia, specie specifico.

Tutte le specie che si riproducono sessualmente: diploidia, numero pari di cromosomi.

Coppia di cromosomi omologhi (autosomi), oltre i sessuali che sono eterosomi.

Ogni specie animale è caratterizzata da un proprio assetto di cromosomi che si mantiene costante, per numero e morfologia, di generazione in generazione.

Negli individui appartenenti a specie a riproduzione sessuata, questo aspetto è costituito da n paia di cromosomi, che nel loro insieme costituiscono il corredo cromosomico, o cariotipo diploide 2n.

Per ogni coppia: un cromosoma di origine materna e uno di origine paterna.

Nessuna correlazione tra numero cromosomi e numero di geni.

Importanza dello studio del cariotipo in medicina

• 1:200 neonati ha una patologia cromosomica.
• Oltre il 50% degli aborti spontanei ha anomalie cromosomiche, soprattutto aneuploidia.
• 1:100 individui sani ha anomalia bilanciata che può essere associata a infertilità/poliabortività, rischio di trasmissione alla progenie in modo non bilanciato.

La maggior parte dei tumori ha anomalie cromosomiche multiple.

Cromosomi omologhi

Uno di derivazione materna, uno di derivazione paterna.

I membri di una coppia di cromosomi sono chiamati omologhi, sono uguali per forma e posizione dei loro centromeri.

Portano l'informazione per il controllo dello stesso tipo di caratteristiche genetiche, sebbene non necessariamente un'identica informazione: uno potrebbe avere un gene mutato e l'altro no.

I cromosomi omologhi contengono DNA che codifica per le stesse proteine.

Hanno gli stessi geni nella medesima posizione, ma possono presentare varianti diverse (allele).

Nell'analisi del cariotipo, cromosoma formato da due cromatidi.

Possibile da effettuare solo su cellule in grado di dividersi, cellule bloccate durante la mitosi.

Già avvenuta replicazione, per questo sono due, e in fase di divisione.

Importanza dell'analisi dei cromosomi durante divisione, cromatina superavvolta, visibile al microscopio ottico.

Impacchettamento della cromatina all'interno del nucleo, necessario soprattutto per la regolazione dell'espressione genica.

Variazione del contenuto di DNA nei cromosomi durante ciclo cellulare

Fase S: 46 cromosomi lineari, una doppia elica per cromosoma 2C.

Fase G2: 46 cromosomi, due doppie eliche per cromosoma 4C.

Sempre stesso numero, ma cambia contenuto di DNA.

Componenti strutturali e funzionali di un cromosoma

Regione centromerica: costrizione primaria, importanza durante la divisione lungo asse in un punto.

Mantiene uniti i cromatidi fratelli.

Braccio lungo q, braccio corto p.

Cinetocore: componente del centromero su cui prendono attacco i microtubuli del fuso.

Duplice, uno per ciascun cromatidio.

Regione telomerica: DNA ripetuto, essenziali per il mantenimento dell'integrità del cromosoma.

Hanno una sequenza comune, nell'uomo TTAGGG.

Assicurano la completa replicazione del DNA, le sequenze ripetute sono riconosciute dalla telomerasi, la cui attività contrasta l’accorciamento progressivo dei cromosomi dovuto al susseguirsi dei cicli normali di replicazione del DNA.

I telomeri sono essenziali per la stabilità dei cromosomi, favoriscono i legami con le proteine telomeriche che costituiscono la capsula protettiva. La loro perdita determina instabilità delle estremità con la tendenza ad associarsi con altre estremità rotte di altri cromosomi, coinvolti in eventi di ricombinazione o degradazione. Protezione delle estremità dei cromosomi dalla degradazione e dalla fusione coda-coda con altri cromosomi.

Storia della citogenetica

1950: si pensava il numero dei cromosomi fosse 48, come gorilla, nell'uomo una copia è fusa.

Errore perché a volte si usavano cellule tumorali per valutare numero dei cromosomi.

1956: individuato numero corretto dei cromosomi, tecniche di bandeggio.

Fondamentale per conoscere sindromi e patologie genetiche.

1959: Lejeune, analisi di sangue periferico di pazienti con sindrome di Down, scoprì un cromosoma 21 in più.

1960: cromosoma Philadelphia in leucemia mieloide cronica, piccolo cromosoma 22.

1960: Conferenza di Denver, assegnare nome ai cromosomi.

Classificazione dal più grande al più piccolo, 21 più piccolo di 22.

Suddivisione in gruppi.

1970: bandeggi, colorazioni particolari, alternanza bande chiare/scure, fluo/no fluo.

A sinistra: bande Q con mostarda di Quinacrina.

A destra: bande G con tripsina-Giemsa.

1986: inizio dell’epoca della citogenetica molecolare.

Ibridazione in situ: applicazione di tecniche molecolari di ibridazione su preparati citologici, basati sull’osservazione che sequenze nucleotidiche erano in grado di appaiarsi e formare degli ibridi stabili.

Prima utilizzo di anticorpi marcati con molecole fluorescenti in grado di individuare in modo specifico ibridi di DNA/RNA, successivamente si fu in grado di marcare direttamente e indirettamente sonde con fluorocromi.

Analisi del cariotipo

Necessario per lo studio dei cromosomi.

• Allestimento di una coltura.
• Preparazione vetrini.
• Colorazione del preparato con colorazioni differenziali di routine.
• Osservazione al microscopio ottico, selezione delle metafasi, conta dei cromosomi delle diverse metafasi, acquisizione delle immagini e ricostruzione del cariotipo.

1) Allestimento colture

Necessario avere cellule proliferanti da bloccare in metafase.

Fonti di cellule in divisione: prelievo di sangue periferico con eparina.

Oppure utilizzo di midollo osseo, colture da tessuti ossei (fibroblasti, linfonodi, tumori solidi), colture da tessuti abortivi, liquido amniotico, villi coriali, sangue fetale, linee cellulari immortalizzate (scopo di ricerca).

Sono necessari:

• Anticoagulanti: eparina (anticoagulante).
• Terreno con soluzioni saline isotoniche, aminoacidi, vitamine, nucleotidi, indicatore pH.
• Siero con fattori di crescita, zuccheri, proteine.
• Mitogeni: fitoemoagglutinina PHA stimola proliferazione clonale di linfociti T.
• Lipopolisaccaridi LPS inducono proliferazione dei linfociti B.
• Specifici in base a cosa si deve analizzare.
• Veleni mitotici: bloccano cellule durante la metafase.

Colchicina impedisce formazione del fuso mitotico, impedisce completamento della divisione cellulare.

Fibroblasti hanno capacità di aderire alla flaska, a confluenza si staccano con tripsina e si dividono in più flask diverse.

Cellule in via di divisione non sono adese alla flask, ma assumono morfologia tondeggiante, non si usa tripsina ma si batte la flask.

2) Preparazione dei vetrini

Utilizzate stanze con cappe in modo da creare ambiente ideale per le cellule.

Le cellule vengono risospese in una quantità opportuna di fissativo fresco.

Fatte cadere mediante sgocciolamento, 2/3 gocce, su vetrini pretrattati con miscela di alcool assoluto e HCl posti in acqua distillata.

Dropping: cellule man mano si asciugano, spread e distribuzione dei cromosomi.

Se condizioni non ottimali, citoplasma resta adeso ai cromosomi, oppure possono disporsi troppo lontani fra loro.

Cromosomi della stessa cellula devono rimanere vicini fra loro.

Umidità e temperatura dell'ambiente devono essere controllate: temperatura di 20 °C con un'umidità di poco superiore al 50%.

3) Colorazione del preparato con colorazioni differenziali

Cromosomi vengono classificati in base alla loro dimensione e alla posizione del centromero.

In base alla posizione del centromero si distinguono in metacentrici.

Centromero a metà, le braccia sono molto simili.

Submetacentrici.

Centromero verso l’alto, braccio corto sopra e braccio lungo sotto.

Acrocentrici.

Braccio corto molto piccolo, presenza di DNA satellite altamente ripetuto.

Sebbene la posizione del centromero e la lunghezza relativa dei due bracci aiutino l’identificazione di specifiche coppie di cromosomi, alcuni cromosomi sembrano identici utilizzando solo questo criterio.

Tecniche di bandeggio cromosomico

L’abilità di identificare con certezza specifici cromosomi è stata conquistata con la scoperta di alcuni fluorocromi e con la messa a punto di protocolli di bandeggio cromosomico che usati creano un’alternanza di bande chiare e scure lungo l’asse del cromosoma, specifica per ogni coppia di omologhi, pattern riproducibile di bande.

Il bandeggio cromosomico è da allora diventato standard e indispensabile per l’analisi citogenetica.

Ognuna di queste tecniche produce un pattern di bande chiare e scure, fluorescenti e non, lungo l’intero cromosoma.

Ogni coppia di cromosomi mostra un unico pattern di bandeggio, analogo ad un ‘bar code’ che ci permette di differenziare l’uno dall’altro cromosomi della stessa dimensione e stessa posizione del centromero.

Bande G

Trattamento con Tripsina, colorazione con Giemsa.

Bande scure ricche in AT.

Bande Q

Colorazione con Quinacrina, colorante fluorescente che non si lega alle zone ricche in AT.

Nelle regioni ricche in AT la fluorescenza è più stabile e quindi più luminosa perché decade lentamente.

Bande R

Denaturazione al calore in soluzione salina, poi colorazione con Giemsa.

Denaturazione delle zone ricche in A e T, quindi si ottiene un pattern di bandeggio reverse rispetto al bandeggio G.

Bande C

Denaturazione in soluzione satura di idrossido di bario, poi colorazione con Giemsa.

Mettono in evidenza l’eterocromatina costitutiva.

Bandeggio G

Prodotto dalla colorazione con Giemsa dopo la digestione enzimatica con tripsina.

• Bande scure, bande G, replicano tardivamente, hanno cromatina condensata e ricche in AT.
• Bande chiare, G negative, replicano precocemente, hanno cromatina meno condensata e ricche in GC.

Bande scure contengono pochi geni, quelle chiare ne contengono molti.

Bandeggio Q

Cromosomi vengono colorati con Quinacrina fluorescente e osservati in fluorescenza.

• Bande fluorescenti sono ricche in AT.
• Bande spente sono ricche in GC.

Bandeggio R

Bande chiare: regioni ricche in AT.

Bande scure: regioni ricche in CG.

Esistono due metodiche:

• RHG: denaturazione con il calore, 85 °C, delle regioni AT che contengono solo due legami a idrogeno, per questo si denaturano velocemente, mentre le regioni CG restano in forma nativa.
• Colorazione con Giemsa, si colorano solo le regioni ricche in GC, bande scure.
• RBA: si ottiene aggiungendo in coltura nella fase tardiva S del BrdU, bromodiossiuridina, con incorporazione dello stesso solo nel DNA che si replica tardivamente, i cromosomi ottenuti vengono colorati con Arancio di Acridina.

Le bande fluorescenti sono quelle ricche in GC, le bande più spente sono quelle ricche in AT.

Zone di replicazione tardiva incorporano il BrdU e non si colorano molto perché la fluorescenza decade subito.

Regioni con replicazione tardiva hanno aspetto più pallido.

Metodica per distinguere quale cromosoma X è attivo: quella inattiva ha un aspetto più pallido, nessuna distinzione di basi per la colorazione omogenea.

Bandeggio C

Non consente la composizione del cariotipo.

Colorazione di regioni di eterocromatina costitutiva.

Cromosomi denaturati con idrossido di bario e colorazione con Giemsa.

Visualizzazione degli scambi tra cromatidi fratelli

Quando BrdU è presente per due interi cicli cellulari, un cromatide conterrà una sola catena polinucleotidica con l’incorporazione mentre l’altra avrà incorporato su entrambe le catene.

Colorazione NOR

Permette la visualizzazione delle braccia corte dei cromosomi acrocentrici, RNA ribosomiale altamente ripetuto.

Come si fa il cariotipo?

• Si contano i cromosomi: importante per escludere la presenza di alterazioni del numero cromosomico.
• Appaiamento degli omologhi per similarità.
• Si mettono in ordine secondo la convenzione.

Terminologia:

46, XX: cariotipo normale femminile.

46, XY: cariotipo normale maschile.

Numero totale dei cromosomi e sesso.

Sistema internazionale di nomenclatura ISCN

Ogni braccio è suddiviso in regioni, ogni regione è numerata a partire della regione più vicina al centromero, prossimale, a quella più lontana, distale, numerazione da centromero verso telomero.

Braccio corto p.

Braccio lungo q.

Risoluzione diversa in bandeggio, di solito utilizzata quella di 400 bande.

Per avere una risoluzione diversa deve variare il grado di condensazione della cromatina.

Con un cariotipo standard si riesce a vedere un riarrangiamento che sia maggiore di 5/10 Mb.

Vi possono essere alcune varianti fra i cromosomi omologhi, ma sono polimorfismi.

Di solito coinvolgono regioni eterocromatiche e con sequenze ripetute, 1, 6, 16 cromosomi acrocentrici.

Variazioni dell’eterocromatina pericentromerica.

Un cromosoma diverso dall’altro, differenze tra cromosomi omologhi.

Può esserci polimorfismo per il cromosoma Y, variazioni di grandezza del braccio lungo.

Esistono anche dei polimorfismi eucromatici che non sortiscono effetto patologico, cromosoma 9/18.

Quando le cellule vengono messe in coltura, possono riscontrarsi delle regioni soggette a rottura: regioni fragili.

Siti fragili sono una specifica regione cromosomica che appare come un intervallo non colorato, gap, o come una franca rottura sul cromosoma metafasico.

Anomalie cromosomiche

La citogenetica clinica studia i cromosomi, la loro struttura ed eredità applicati alla pratica della genetica medica.

Le anomalie cromosomiche rappresentano la classe principale delle malattie genetiche.

Possono essere:

• Bilanciate: nessuna perdita di materiale genomico, nella maggioranza dei casi non vi è fenotipo anomalo.
• Non bilanciate: perdita o acquisizione di materiale genetico, fenotipo patologico, malformazioni e/o ritardi mentali.

La gravità è correlata al tipo di cromosoma e alla quantità dei geni interessati.

Tanto più grave è lo sbilanciamento cromosomico, tanto più grave sarà il fenotipo o più precoce l'aborto spontaneo.

Severità dipende dal numero di geni presenti e dalla grandezza del segmento coinvolto.

Se sono geni sensibili al dosaggio o meno.

Per anomalie cromosomiche si intendono le mutazioni che producono un'alterazione cromosomica.

Possono essere suddivise in anomalie di numero e anomalie di struttura.

Le anomalie cromosomiche possono essere:

• Costitutive: tutte le cellule sono portatrici di un riarrangiamento, difetto già nello zigote.
• Acquisite: post-zigotico, mosaicismo, cellula tumorale.

Non tutte le alterazioni possono essere identificate perché esiste un limite di risoluzione pari a 5-10 Mb, citogenetica standard.

Anomalie cromosomiche del numero

Poliploidie: triploidie, tetraploidie.

Aneuploidie: trisomie, monosomie.

Anomalie cromosomiche della struttura sbilanciate

Delezioni, duplicazioni, isocromosomi, cromosomi ad anello, marcatori sovrannumerari.

Anomalie cromosomiche della struttura bilanciate

Traslocazioni, reciproche e robertsoniane, inversioni, paracentriche e pericentriche, inserzioni.

Le anomalie cromosomiche rappresentano la patologia più frequente del concepimento e, nonostante la fortissima selezione naturale mediante l'aborto spontaneo, la loro frequenza alla nascita è elevata.

Alta instabilità genomica e cromosomica durante le prime divisioni cellulari a livello embrionale.

Solo 25/30% dei concepimenti riesce a sopravvivere, alto livello di riarrangiamenti che provocano aborto durante le prime divisioni cellulari.

La presenza di questi riarrangiamenti spiega la presenza di mosaicismo a livello placentare che può essere visibile durante l'analisi dei villi coriali.

Nel caso bilanciato, il mosaicismo è confinato alla placenta e agli annessi embrionali.

Embrione ha cellule normali.

Come si è capito che questo evento non è così raro?

Analisi blastomero per blastomero di 23 embrioni, tecniche di fecondazione assistita.

Solo 2/23 non presentano riarrangiamenti.

Instabilità cromosomica molto comune nelle prime fasi di sviluppo embrionale.

Anomalie di numero

Euploidie: cellula che contiene set cromosomico completo, esatto multiplo del numero cromosomico aploide.

Poliploidia: costituzione di cellule o organismi che contengono un set cromosomico in più.

Triploidi: contengono un set completo in più di cromosomi, 3n.

Tetraploidi: contengono due set in più, 4n.

Aneuploide: coinvolge solo alcuni cromosomi, non intero set cromosomico.

Singoli cromosomi in copia aggiuntiva, anomalie di singoli cromosomi.

Trisomia se vi è la presenza di un cromosoma in più.

Monosomia se presente solo una copia.

Nullisomia: mancano entrambi i cromosomi di una coppia, non compatibile con la vita.

Triploidia

Cellule che hanno 69 cromosomi, 3n.

Cariotipo 69XXX, 69XYY, 69XXY.

Causata da una doppia fertilizzazione.

Causate da un’errata divisione meiotica della cellula uovo, causata ad esempio dalla ritenzione del corpo polare, o del gamete maschile.

15% degli aborti spontanei, una delle cause più comuni.

Due apporti materni causano un aborto molto precoce.

Set di geni espressi solo da cromosoma paterno, certi solo da cromosoma materno: il loro apporto non è lo stesso.

Tetraploidie

Cariotipo 92, XXXX o XXXY, risultato di una non corretta divisione mitotica di una cellula 2n.

6% aborti spontanei con causa cromosomica, si possono trovare in tumori solidi.

Endomitosi: replicazione non seguita da divisione cellulare.

Aneuploidie

Cellule con cromosomi in più e in meno, ma non equivalente ad un multiplo esatto del corredo aploide.

Sovrannumero o mancanza di un cromosoma.

Rappresentano le più frequenti aberrazioni cromosomiche numeriche.

• Trisomia: presenza di un cromosoma aggiuntivo.
• Tetrasomia: presenza di due cromosomi aggiuntivi.
• Monosomie: mancanza di un cromosoma.

Rappresentano il principale fattore eziologico alla base di un alterato sviluppo fetale.

Spesso aborto nelle prime settimane, alta selezione.