Farmacologia I semestre

Corso di farmacologia

Il bersaglio terapeutico

I farmaci agiscono perché interagiscono secondo leggi fisico-chimiche con dei bersagli terapeutici che possono essere recettori, enzimi, canali ionici, trasportatori. Il farmaco non crea delle funzioni, ma interferisce con meccanismi preesistenti, modificandoli, modulandoli. Il farmaco va a sostituire, ad antagonizzare qualcosa che è già presente.

Esiste una precisa correlazione tra la quantità di farmaco e la quantità di bersagli: la risposta è direttamente proporzionale alla concentrazione di ligando e recettore.

Quali sono i bersagli terapeutici

Enzimi (28%), recettori (45%), canali ionici (5%), recettori nucleari (2%), DNA (2%), ormoni e fattori (11%) e il 7% è sconosciuto. Il 50% sono recettori integrali di membrana. La gran parte delle patologie è legata a problemi di comunicazione cellulare. L’albumina (proteina plasmatica) lega farmaci e li trasporta. L’albumina è un sito di legame per i farmaci, ma non è un recettore poiché il recettore è in grado di trasdurre il segnale una volta che lega il ligando. Si dovrebbe fare uno studio randomizzato controllato in doppio cieco, in cui si compara con il placebo, non è sempre possibile per problematiche bioetiche.

Il farmaco è una molecola dotata di attività biologica; sono sostanze dotate di proprietà terapeutiche. La maggior parte dei farmaci agisce attraverso specifici recettori, però esistono anche altre categorie che non agiscono mediante interazione con un recettore. Tra questi troviamo gli insetticidi, gli acidificanti o alcalinizzanti, sostanze osmoticamente attive (diuretici, lassativi), gli anestetici e l’alcol. In farmacologia, il recettore è definito come macromolecola a cui il farmaco si lega e ne modifica la funzione. Classifichiamo i farmaci che agiscono attraverso specifici recettori in due modi:

• Agonista: farmaco che legandosi al recettore genera una risposta biologica, generalmente mimando gli effetti di composti endogeni.
• Antagonista: farmaco che legandosi al recettore non produce nessun effetto e inibisce (parzialmente o completamente) l’effetto dell’agonista che agisce sullo stesso recettore.

Recettori

La comunicazione avviene per lo più attraverso la produzione e la liberazione di molecole chiamate mediatori o trasmettitori o ormoni, capaci di diffondere dal sito di produzione e di legare componenti della cellula chiamati recettori. Il recettore non è solo in grado di riconoscere e legare il mediatore in uno specifico modo, ma, attraverso una modificazione conformazionale, generare una risposta cellulare. Non sono solo dei siti di legame, ma sono molecole glicoproteiche che sono in grado di trasdurre il segnale. Un recettore può trovarsi in più stadi funzionali e l’interazione con un farmaco può spostare l’equilibrio verso uno di tali stati.

Recettori di membrana

I recettori di membrana trasducono il segnale portato da mediatori idrofilici (neurotrasmettitori classici e peptidici, fattori di crescita, citochine etc.) generando modificazioni biofisiche e biochimiche. Questi trasducono il segnale generando modificazioni delle concentrazioni ioniche o mediante la produzione di secondi messaggeri o stimolando la formazione di macrocomplessi molecolari biologicamente attivi.

Tre classi di recettori di membrana:

• Recettori canale: si tratta di complessi oligomerici transmembranari che formano un canale ionico la cui probabilità di apertura è regolata dall’interazione con il ligando o con il farmaco agonista (l’apertura induce un flusso ionico che modifica rapidamente il potenziale). Agiscono e come risposta danno depolarizzazione o iperpolarizzazione che canali ionici voltaggio-dipendenti poi attivano. Tempo di risposta: millisecondi. Sono strutture tri, tetra o pentameriche e ogni subunità ha una struttura topografica ben precisa. Di questa categoria fanno parte alcuni dei recettori per i neurotrasmettitori classici ad ampia diffusione nel SNC e SNP come acetilcolina, GABA, glicina, glutammato e serotonina, i recettori attivati dai nucleotidi ciclici cGMP e cAMP e i recettori dell’ATP.
• Recettori accoppiati a G-protein: ci sono 1200 geni per questi recettori. Sono recettori che agiscono nell’ordine di secondi, la risposta non è velocissima. Hanno grandissime funzioni modulatorie. Per parlare con l’effettore necessita della proteina G (legano nucleotidi guanilici).
• Recettori con attività tirosin-chinasica intrinseca: questi recettori impiegano minuti. Sono recettori per GF, su questi agiscono anticorpi monoclonali, farmaci antitumorali. Regolano duplicazione, apoptosi, infiammazione, quindi una serie di risposte molto più lente. Questi recettori attraversano una sola volta la membrana plasmatica.
• Recettori dotati di attività guanilato ciclasica intrinseca.

I recettori oppioidi sono 4 e 4 ligandi endogeni, così come i recettori cannabinoidi.

Recettori intracellulari

I recettori intracellulari sono localizzati all’interno della cellula (nel citosol o nel nucleo). I ligandi sono liposolubili (ormoni steroidei, acido retinoico, ormoni tiroidei, vitamina D): circolano nel sangue associati all’albumina o altri trasportatori, ma possono attraversare la membrana. Sono fattori di trascrizione attivati dal ligando, sono regolatori dell’espressione genica poiché interagiscono con le sequenze specifiche del DNA.

Recettori canale

Pentamero con due subunità alfa, una beta, una gamma, una delta che delimitano un canale che è chiuso. Quando Acth si lega, si innesca una modificazione conformazionale nel recettore che lo fa aprire e possono passare Na e K. La conseguenza è la depolarizzazione della cellula. Per modificazione conformazionale si intende una modificazione allosterica. Le modificazioni conformazionali sono reversibili, non sono permanenti. È l’interazione ligando-recettore che comporta la modificazione conformazionale; il recettore si apre e, seguendo il gradiente elettrochimico, passano gli ioni.

Il recettore nicotinico è il primo ad essere stato scoperto e il primo ad essere stato clonato. Il recettore maturo è fatto da alfa, beta, delta e epsilon (gamma diventa epsilon alla nascita). Il cuore non ha i recettori colinergici nicotinici. Questi canali si chiudono spontaneamente. Il recettore della glicina fa passare cloro, un attivatore del recettore della glicina è la strignina. Il recettore del GABA è attivato anche dall’alcol. Nicotina e Acth legano lo stesso punto che è ortosterico del recettore nicotinico.

I curari si utilizzano per paralizzare, per l’anestesia. Su stimolazione da curaro, si ha la paralisi flaccida. Biologicamente i processi sono tutti autolimitanti (si spengono), se non sono in grado di autolimitarsi, si ha la patologia. Il meccanismo di spegnimento è dato dalla modulazione di neurotrasmettitore. L’acetilcolina viene degradata dalla acetilcolina-esterasi. Se rimangono residui di Acth si ha come risposta ultima la paralisi flaccida questo perché come risposta viene disattivato l’ActhR. Di fatto se viene spento e subito ristimolato, si desensibilizza.

Il recettore per il GABA è un altro recettore canale che, al legame con il GABA, fa entrare il Cl quindi iperpolarizzazione della cellula. Questi riducono l’attività del SNC. I farmaci che vanno a legare questo tipo di recettori sono ansiolitici, farmaci per insonnia ed epilessia. Il GABA e le benzodiazepine si legano in siti differenti del recettore che quindi è allosterico. I barbiturici si legano in un punto ancora diverso, all’interno del canale e lo tengono aperto. Si fanno esperimenti di petched-clamp (sono esperimenti di elettrofisiologia) per cui si va a bloccare il voltaggio in questa parte specifica della membrana e si osserva l’attività del canale ionico e le sue caratteristiche fisico-chimiche.

Se viene introdotto il GABA e le benzodiazepine insieme, viene aumentato l’ingresso di cloro (modulazione allosterica positiva da parte delle benzodiazepine). Le benzodiazepine da sole non possono aprire il canale, necessitano del GABA. I barbiturici costituiscono ingombri sterici, non hanno bisogno del GABA per aprire il canale, quindi questi possono ucciderci perché vanno a inibire i centri respiratori da sole. Le benzodiazepine non possono ucciderci poiché necessitano del GABA che è controllato nel nostro corpo.

Recettori accoppiati a G-protein

Questi recettori attraversano la membrana plasmatica 7 volte. La struttura generale è la stessa per tutti, nonostante siano codificate da 1200 geni diversi. Noi pensiamo a questi recettori come monomeri, la realtà è differente poiché ogni tanto dimerizzano. La porzione intracellulare si accoppia con la G proteina. Le proteine G sono una famiglia di molecole proteiche chiamate così per la loro peculiare interazione con i nucleotidi guaninici GTP e GDP. I diversi tipi di ligando, si legano in punti diversi del recettore: dipende dal ligando e dal recettore. I neurotrasmettitori si legano in una tasca idrofilica del recettore, i peptidi si legano sulla porzione idrofilica che congiunge una porzione intramembranale con l’altra. La G proteina è eterodimerica, formata da tre subunità (alfa, beta, gamma).

• Alfa ha attività GTPasica e lega GTP/GDP.
• Beta e gamma sono associate a formare un complesso (beta-gamma), sono idrofobiche e sono ancorate alla superficie citoplasmatica della membrana.

Quando un recettore viene stimolato da un suo ligando, il recettore lega la G protein. Questo introduce una modificazione conformazionale nella subunità alfa (che è quella che si lega al recettore) che perde affinità per il GDP e la acquisisce per il GTP. L’ingresso del GTP induce un’altra modificazione conformazionale in alfa che perde affinità per la subunità beta-gamma. La subunità alfa con GTP legato si va a legare all’adenilato ciclasi o a canali ionici. Questo è un meccanismo controllato nel tempo: alfa ha un’attività GTPasica intrinseca: dopo un certo periodo alfa idrolizza il GTP e torna a legarsi a beta-gamma.

Ci sono diverse isoforme e isotipi di subunità alfa.

• Alfa-s: s sta per stimolatoria: stimola l’adenilato ciclasi.
• Alfa-i: i sta per inibitoria: inibisce l’adenilato ciclasi.
• Alfa-q: attiva la fosfolipasi C.
• Alfa-o: inibisce canali del calcio e attiva canali del potassio, ha a che fare con canali ionici.

Sistemi effettori

1) Sistema dell’adenilato ciclasi

Ci sono numerose isoforme diverse di adenilato ciclasi. Quando arriva l’ormone, il neurotrasmettitore o il farmaco, alfa prende contatto con l’adenilato ciclasi provocandone una modificazione allosterica. L’adenilato ciclasi converte ATP in cAMP che si lega alla PKA. La PKA è un tetramero composto da due subunità catalitiche e due regolatorie. cAMP si lega alle subunità R, inducendone un cambio conformazionale che gli fa perdere affinità per quelle catalitiche che si staccano. L’alfa-i inibisce l’adenilato ciclasi poiché legandosi, impedisce a questa di convertire ATP a cAMP.

Le fosfodiesterasi scindono il legame che rende la molecola ciclica, quindi deciclizzano (cAMP diventa AMP). Le PKA fosforilano un gran numero di proteine citosoliche e nucleari controllando svariate funzioni cellulari. I substrati che vengono fosforilati da questa dipendono dalla localizzazione dell’enzima che è determinata dall’interazione con vari membri della famiglia delle AKAP (PKA anchoring protein) che si legano alle subunità regolatorie del tetramero inattivo e lo posizionano vicino all’effettore e al substrato da modulare (promuovono la formazione di complessi multimolecolari formati da vari componenti della via di segnalazione).

2) Sistema dei fosfoinositidi (fosfolipasi C)

La subunità alfa-q attiva la fosfolipasi C-beta che scinde PIP₂ in IP₃ e DAG. Il DAG è un attivatore della protein chinasi C (PKC): il legame del DAG determina la traslocazione della PKC dal citoplasma alla membrana plasmatica dove cambia conformazione e diventa attiva. Il recettore dell’IP₃ sta sulla membrana del reticolo endoplasmico che è ricco di Ca-ATPasi e calreticuline e calsequestrine. Queste due proteine sequestrano il calcio (proteine chelanti), se non ci fossero il calcio precipiterebbe. IP₃ fa uscire il calcio dal reticolo, se ci si trova in una cellula muscolare, questo comporta la contrazione muscolare.

La fosfolipasi Cγ si attiva invece una volta legata, attraverso i suoi domini SH2-SH3, al grown factor receptor fosforilato. Esistono altre subunità beta: beta-gamma nei recettori muscarinici del nodo seno-atriale aprono i canali del potassio, iperpolarizzando la cellula.

Recettori canale

Il recettore della glicina fa passare cloro, un attivatore del recettore della glicina è la strignina. Il recettore del GABA è attivato anche dall’alcol. Il curaro è una sostanza che se si lega al recettore impedisce l’azione dell’acetilcolina (antagonista), fa da tappo per il legame con ACh. I curari si utilizzano per paralizzare, per l’anestesia. Su stimolazione da curaro, si ha la paralisi flaccida.

I recettori canali hanno l’apertura legata all’azione del ligando che può essere un farmaco o un neurotrasmettitore: cambia la conformazione e permette il movimento degli ioni spinti dal gradiente elettrochimico. Il canale ad un certo punto, anche in presenza del ligando si può chiudere.

Ioni:

• Na: è concentrato fuori circa 15 volte di più rispetto all’interno della cellula.
• K: è concentrato molto di più all’interno.
• Cl: è molto più concentrato all’esterno che all’interno.

A seconda dell’ingresso o dell’uscita di vari ioni, posso avere come risposta depolarizzazione o iperpolarizzazione della cellula.

Sinapsi eccitatoria: il neurotrasmettitore si lega, fa aprire il canale, entra il sodio e si ha depolarizzazione. Nella sinapsi inibitoria, il neurotrasmettitore fa sempre aprire il canale, ma entra il Cl e fa iperpolarizzare la cellula. Il neurotrasmettitore viene sempre rilasciato in seguito ad uno stimolo e, legandosi al recettore, causa depolarizzazione o meno della membrana. Il recettore del GABA determina iperpolarizzazione, ma questo succede solo nei neuroni maturi.

Si è visto che nei neuroni immaturi o in determinate patologie, per un discorso di trasportatori (il gradiente è invertito) quindi il Cl fuoriesce e determina depolarizzazione e non iperpolarizzazione.

Distribuzione tissutale e subcellulare dei recettori canale

Quasi tutti i tipi cellulari possiedono recettori canale, tuttavia essi sono presenti in numero maggiore nelle cellule nervose. Per una corretta funzionalità sinaptica sono indispensabili un’alta densità e una precisa localizzazione dei recettori in sede post-sinaptica (muscolo e SNC). Nei neuroni, inoltre, molti recettori canale sono inseriti nella membrana pre-sinaptica dove modulano il rilascio di neurotrasmettitore regolando l’attività delle sinapsi.

Classi di recettori canale

Esperimento: si prende l’organo elettrico della torpedine, si omogeneizza, poi si solubilizza (poiché il recettore è presente nella membrana) si purifica il recettore e si fa correre sul gel di poliacrilammide. Si fa un’eluizione del peptide da cui si ottengono i frammenti del peptide e si ottiene la sequenza di aa. A questo punto è possibile inserire l’mRNA in una libreria a cDNA per poterlo clonare. Questo è stato il primo recettore ad essere purificato e clonato. Si osserva che è composto da 4 subunità. Facendo esperimenti di cristallografia e osservazione a microscopio si vede che il recettore muscolare è composto da 5 subunità. I recettori canale possono essere suddivisi in diverse classi:

1. AChR (muscolari e neuronali), serotonina (5-HT₃), GABA (GABA_A), glicina (Gly-R) (classe I). Tutti costituiti da 5 subunità su un unico lungo filamento che attraversano 4 volte il piano della membrana (i quattro segmenti transmembrana prendono il nome di M1, M2, M3, M4). I recettori appartenenti a questa classe hanno un’elevata omologia sia strutturale sia funzionale, con una comune struttura dei domini importanti per definire la topologia delle subunità, il sito di legame degli agonisti e la struttura del canale ionico.

Questi recettori sono composti da un dominio N-ter extracellulare (dove si trovano 200 aa che formano il sito di legame all’agonista e un’ansa di 13 aa compresa tra due Cys che forma un loop importante per la struttura terziaria della subunità), 4 porzioni transmembrana e il dominio C-ter extracellulare. Si è scoperto che in natura esiste una proteina chiamata Ach-binding protein; proteina solubile che lega Ach e la sequestra non permettendo che si leghi al recettore. Questa proteina è molto simile dal punto di vista strutturale al recettore muscolare e neuronale. Studiando questa proteina si è potuto osservare come funzionassero i recettori e si capisce che l’Ach interagisce con gli aa all’interfaccia tra la subunità alfa e beta.

2. Glutammato (classe II): a questa classe fanno parte i recettori AMPA, NMDA e kainato. Sono costituiti da 4 subunità che attraversa 3 volte la membrana. Ogni subunità ha una amino terminal domain, regione all’N-terminale extracellulare (ATD), poi si hanno le due regioni s1 e s2 per l’interazione con il glutammato, la ligand binding domain, LBD, la porzione transmembrana (TMD) e una regione C-ter intracellulare. Il dominio transmembrana contiene tre regioni ad alfa-elica (M1, M3, M4) mentre la regione M2 non attraversa il piano della membrანა