Riassunto esame Istologia ed embriologia, Prof. Puzzolo Domenico, libro consigliato Istologia, Rosati P., Colombo R., Maraldi N.

Introduzione all'istologia: organi cavi e pieni

L'istologia serve a riconoscere non le patologie, bensì il normale. Bisogna curare la diagnostica tissutale e si fa in tre livelli: diagnosi di tessuto (istologia), diagnosi d'organo (anatomia e anatomia microscopica), diagnosi isto- e anatomopatologica (anatomia e istologia patologica).

Livelli di osservazione

• Morfologia: lo studio a occhio nudo.
• Struttura: si studia con il microscopio ottico.
• Ultrastruttura: si studia con il microscopio elettronico (a trasmissione e a scansione) e ci permette di vedere all'interno delle cellule (strutture subcellulari).

L'ultrastruttura si può studiare anche tramite una microscopia di tipo ottico, non solo elettronico, e si parla di immunoistochimica. Ad esempio, nel polmone si osservano i corpi osmiofili multilamellari che contengono il fattore surfactante e si possono osservare al microscopio ottico tramite marcatura con una determinata sostanza, poiché si illumina ed è dunque visibile. Si parla allora di ultrastruttura indiretta.

Organi e visceri

Vi è differenza tra organo e viscere. I visceri sono contenuti nella cavità addominale o toracica; gli organi sono specifici di una funzione (es. occhio organo della vista). Gli organi (e visceri) si suddividono in cavi e pieni.

Organi cavi

I cavi sono formati da tonache concentriche (es. intestino e trachea) che possono essere di quattro tipi: mucose, sottomucose, muscolari, avventizie o sierose. Lo spessore delle tonache dipende dagli organi. In quasi ogni organo cavo vi sono tutti i tipi di tonaca. Nell'utero, ad esempio, mancano la tonaca mucosa e sottomucosa, sostituite da un'unica tonaca chiamata endometrio (che non è la loro fusione). La parte interna di un organo cavo si chiama lume. Nella descrizione degli organi cavi si parte sempre dall'interno.

Le tonache

Mucosa: è formata da tre strati che sono l'epitelio, la membrana basale e la lamina propria. Il tessuto epiteliale è di rivestimento ed è il primo strato della mucosa. Esso poggia su una membrana basale, una struttura molto sottile non visibile al microscopio ottico, poiché va oltre il suo potere di risoluzione. La lamina propria si trova subito al di sotto della membrana basale, ma non sempre è presente, come, ad esempio, nell'uretere, che possiede una tonaca mucosa particolare. Nella lamina propria ci sono due tipi di tessuto: connettivo e muscolare liscio.

Sottomucosa: si trova all'esterno della mucosa (rispetto l'organo) ed è principalmente costituita da tessuto connettivo, ma ci sono delle eccezioni, come nella trachea, in cui vi sono anche tessuto ghiandolare e cartilagineo.

Muscolare: si trova all'esterno della sottomucosa e normalmente è formata da due strati: uno circolare interno e uno longitudinale esterno. Se avessimo solo lo strato circolare (es. nell'esofago basso) ed esso si contraesse, il contenuto verrebbe spremuto verso l'alto e verso il basso. Se avessimo solo lo strato longitudinale ed esso si contraesse, si accorcerebbe ma il contenuto rimarrebbe intatto senza muoversi. È dunque necessaria la compresenza dei due strati per evitare che il contenuto torni indietro. Solo in un caso ciò non accade: il vomito o onda antiperistaltica. Esso si classifica in base al punto in cui inizia l'onda antiperistaltica: dallo stomaco (cibo poco digeribile), dall'intestino tenue o dall'intestino crasso (vomito fecaloide). La tonaca muscolare nell'esofago e nello stomaco è costituita da tre strati, mentre nell'utero da quattro.

Avventizia o sierosa: è il rivestimento più esterno. L'avventizia inizialmente non faceva parte dell'organo, ma si è aggiunta in seguito. È costituita da tessuto connettivo. La si può trovare in quegli organi che devono stare in contatto con altri organi e generalmente hanno rapporti stretti. Ad esempio, l'esofago, nel mediastino, contrae rapporti con altri organi, tra cui la trachea, che si trova immediatamente davanti l'esofago. Il contatto tra i due è permesso dalla tonaca avventizia di entrambi gli organi.

La sierosa è così detta perché contiene un velo di liquido sieroso (che deriva dal sangue). Le membrane sierose del nostro corpo sono il peritoneo, la pleura, il pericardio e la tonaca vaginale del testicolo (nei maschi). La tonaca sierosa è costituita da due componenti: il mesotelio e il connettivo submesoteliale. Vi sono cellule pavimentose.

Classificazione rispetto al peritoneo

Rispetto al peritoneo gli organi sono classificati in quattro tipologie:

• Extra-peritoneali (stomaco-intestino tenue)
• Retro-peritoneali (rene-pancreas)
• Sotto-peritoneali (vescica urinaria)
• Intra-peritoneali (ovaio)

Extra-peritoneale vuol dire che è al di fuori del peritoneo, ma lo stomaco ne è comunque avvolto. La lamina di peritoneo che si forma è detta mesentere (si dice che fa ernia). Vi sono due foglietti peritoneali: parietale e viscerale. Tra i due vi è un liquido, per evitare che vi sia un surriscaldamento dovuto all'attrito. Se rimane sulla parete posteriore si chiama retro-peritoneale. Se non ha rapporti stretti è sotto-peritoneale. Se è dentro è intra-peritoneale.

Classificazione di tipo T (tumori)

• T1: solo mucosa
• T2: mucosa, sottomucosa e muscolare
• T3: tutto l'organo
• T4: invade anche altri organi

Gli organi pieni

Gli organi pieni si suddividono in parenchimatosi e spugnosi (ovvero i polmoni, anche se hanno il parenchima polmonare). Gli organi pieni non hanno gli strati, ma sono formati da tre componenti: una capsula (rivestimento esterno), lo stroma e il parenchima.

Nell'uomo è difficile da osservare una struttura esagonale nel parenchima. La capsula delimita l'organo, dà aggancio ai mezzi di fissità, dà supporto dei vasi e dei nervi e regola il volume dell'organo. Può essere fibrosa, fibroelastica o fibromuscolare. Lo stroma suddivide l'organo (es. lobuli epatici suddivisi dallo stroma), contiene i vasi sanguigni, linfatici, i nervi e i dotti escretori e fa da supporto al parenchima. Il parenchima è l'insieme delle cellule e dei tessuti responsabili delle funzioni di un organo. Può essere epiteliale o di altro tipo.

Le dimensioni e il potere di risoluzione, studio di un campione istologico

Micrometro o micron (µm) = 1/1000 di mm

Nanometro (nm) = 1/1000 di micron

Angström (Å) = 1/10000 di micron

Anno luce = distanza che un fotone percorre in un anno; un fotone percorre circa 300 km/s.

Il potere di risoluzione

Il potere di risoluzione è la distanza minima alla quale si possono vedere due punti separati tra di loro, poiché se si avvicinassero se ne vedrebbe solo uno. Il calcolo di questa distanza è data una formula (formula di Abbe): λ/(2nR = x sen)- λ (lambda) = lunghezza d'onda di una radiazione elettromagnetica- n = mezzo di rifrazione del mezzo interposto tra la sorgente dell'onda elettromagnetica e l'occhio- sen = angolo di apertura di una lente. Se prendiamo come riferimento l'occhio umano, è la lunghezza d'onda della luce, n è l'aria, sen indica le cinque lenti dell'occhio: film lacrimale, cornea, umor acqueo, cristallino, umor vitreo; indica l'apertura che un fascio di fotoni compie uscendo dalla lente. L'occhio umano ha dunque un potere di risoluzione di 0,2 mm: ciò significa che se si avvicinano due punti a meno di 0,2 mm, l'occhio umano vede un solo e unico punto.

Al microscopio ottico rimane invariata, 2n varia ma molto poco, sen varia molto ed è ciò che ci dà l'ingrandimento (cambia angolo di apertura delle lenti del microscopio). Il potere di risoluzione di un microscopio ottico è 0,2 µm. Se si osservano gli organuli di una cellula, essi si osservano meglio al microscopio elettronico, poiché essi sono più piccoli del potere di risoluzione del microscopio ottico, ma non di quello elettronico al medesimo ingrandimento. Potere di risoluzione e ingrandimento, dunque, viaggiano separati.

Tipi di microscopi ottici

• Stereomicroscopio
• Microscopio fotonico o luce in campo chiaro
• In campo scuro
• Polarizzatore
• A contrasto in fase
• Invertito
• A fluorescenza

Tipi di microscopi elettronici

• A trasmissione (TEM)
• A scansione (SEM)
• STEM
• Effetto tunnel
• A forza atomica

Studio di un campione istologico

Preparazione di un vetrino o campione istologico

Vi sono delle fasi con le relative tempistiche classiche (tempi che mediamente non si possono né allungare né accorciare e che dipendono dalla grandezza del pezzo da esaminare):

1. Prelievo
2. Fissazione, da 1h a 2gg
3. Disidratazione, da 6h a 4gg
4. Diafanizzazione, da 1h a 3h
5. Inclusione, da 1 a 2gg
6. Taglio
7. Colorazione
8. Allestimento del vetrino

Fissazione

Il primo passaggio è la fissazione. L'istologia studia solo i tessuti normali, dunque il campione da esaminare deve essere il più simile possibile a un tessuto normale. Dopo la morte, si deve cercare di preservare le cellule di un tessuto per mantenerle il più simili possibile al tessuto normale e ciò avviene attraverso la fissazione. Le cellule possono morire in due modi: per apoptosi, con fagocitosi da macrofagi, o per necrosi. Che sia per l'uno o per l'altro, si formano sempre delle strutture subcellulari dette autofagosomi, ovvero parti della cellula che vengono ingerite dai lisosomi. Ciò avviene perché dopo la morte, il sangue, che è il più grande sistema tampone del nostro corpo, assume un pH più acido e ciò provoca l'apertura dei lisosomi (prima risposta dopo la morte).

La fissazione può avvenire per mezzi fisici o chimici: i primi sono tramite il freddo o il caldo, i secondi sono tramite sostanze liquide o miscele. Un esempio di fissazione fisica è quella attraverso l'azoto liquido, che presenta una temperatura di -190°C: basta mettere un frammento istologico per un secondo nell'azoto liquido affinché esso venga fissato.

Le sostanze chimiche, invece, vengono usate tramite due metodi: la perfusione, ovvero l'uso del circolo sanguigno per far arrivare il liquido fissativo verso l'organo che si vuole fissare, e l'immersione, ovvero viene preso un frammento e lo si mette nel liquido fissativo. Nel primo caso, prima bisogna togliere il sangue, altrimenti esso, in quanto tessuto, verrebbe fissato, e solo dopo può essere immesso il liquido fissativo, che deve avere la stessa temperatura corporea e la stessa identica pressione fisiologica. Nel secondo caso, il liquido entra nel frammento istologico per diffusione, ma non è necessaria l'eliminazione del sangue. Il metodo migliore è dunque la perfusione, ma non sempre è possibile, soprattutto se il frammento istologico è molto piccolo.

I liquidi fissativi hanno due proprietà inversamente proporzionali tra di loro: la velocità di penetrazione nel tessuto e la qualità di conservazione. Essi agiscono sulle proteine e possono avere un'azione sulla loro idratazione: essi sono i fissativi coagulanti e sono alcolici a 95°. Vi sono anche gli additivi e la più importante è la formaldeide (HCOH), con un potere di penetrazione di 0,8mm/h. Per quanto riguarda la diluizione, la formaldeide è considerata pura al 40%, la formalina al 10%, ma in realtà è al 4%, la paraformaldeide è al 4%. Due miscele di liquidi fissativi sono il Bouin, in cui è presente la formaldeide, e lo Zenker, preparato senza acido acetico. Una volta fissato il campione, bisogna lavarlo per mantenerne il pH costante.

Disidratazione

Il secondo passaggio è la disidratazione. Si deve togliere l'acqua e sostituirla con un altro liquido, ovvero l'alcool etilico (da una concentrazione di alcool e acqua distillata di 50° fino a 100°).

Diafanizzazione

Il terzo passaggio è la diafanizzazione, cioè si deve “vedere attraverso”. Durante questo processo, il preparato assume una consistenza ottica semitrasparente come risultato. Si utilizza lo xylolo o xylene, ovvero un alcool incolore e miscela di isomeri, una sostanza chimica che è simile sia alla sostanza usata precedentemente, ovvero l'alcool etilico, e quella successiva, ovvero la paraffina (vi deve dunque essere una doppia affinità). Per verificare se è stata tolta tutta l'acqua nel passaggio precedente, basta osservare lo xylolo: se emulsiona vuol dire che è rimasta molta acqua e la disidratazione non è stata eseguita correttamente. In questo caso, si fa il processo inverso: si passa dall'alcool 100° al 50° per togliere tutto l'alcool e far rimanere solo l'acqua e, successivamente, bisogna ripetere la disidratazione.

Inclusione

Il quarto passaggio è l'inclusione. Per la microscopia ottica si usa la paraffina, ovvero una cera. Per la microscopia elettronica, invece, si usano le resine epossidiche. Lo xylolo è il solvente della paraffina, ma questa non è liquida, quindi bisogna riscaldarla attraverso una stufa termostatata per farla diventare liquida. Il suo punto di fusione è di circa 58°. Si prende allora un frammento dallo xylolo e lo si mette in una boccetta con metà xylolo e metà paraffina, poi si prende lo stesso frammento e lo si mette in una boccetta in cui vi è solo paraffina e, infine, lo si riprende e lo si rimette in un'altra boccetta con solo paraffina per essere certi che non vi siano residui di xylolo, altrimenti esso renderebbe il frammento morbido.

Taglio

Il quinto passaggio è il taglio. Per effettuarlo la paraffina si deve prima solidificare e per fare ciò basta toglierla dalla stufa e, dunque, farla raffreddare. Bisogna però prima possedere dei bozzetti d'acciaio e dei supporti in plastica per farci colare la paraffina liquida, così da ricavare solo uno stampo con il frammento incluso dentro. Il pezzo viene incluso perché la paraffina si trova anche dentro di esso e dunque, quando si taglia, ciò che viene tagliato è solo paraffina e la lama d'acciaio non sente alcuna differenza.

Microscopio ottico ed elettronico

Studio di un campione istologico dal taglio

Nello studio di un campione istologico, il passaggio successivo all'inclusione è il taglio. Prima di effettuarlo, il che avviene attraverso l'uso del microtomo, che ha lo stesso potere di funzionamento di un'affettatrice, bisogna dare una consistenza uniforme al preparato e ciò è possibile grazie all'inclusione, durante la quale il frammento istologico viene immesso nella paraffina. Una volta fatto ciò, è possibile passare al taglio tramite il microtomo. Esso possiede una manovella, una manopola per regolare lo spessore della fetta, una lama e il suo scopo è quello di tagliare il blocchetto di paraffina con il pezzo istologico dentro. Ogni volta che si gira la manovella, l'unica differenza con la comune affettatrice, è che la lama resta ferma, ma la paraffina avanza (a ogni giro il braccio avanza di quanto è stato settato). Lo spessore delle fette varia in base al tipo di studio che si deve fare: se si deve fare uno studio di routine istologico, le fette sono mediamente spesse 7 μm, ma se gli studi sono specifici, le fette possono scendere di spessore anche fino a 4 μm, mentre, in altri casi ancora, lo spessore può essere maggiore, come di 30-35 μm.

Le fette vengono tagliate una appresso all'altra (sezioni seriate). Poi la singola fetta viene messa in acqua fredda e in seguito in acqua calda-tiepida (intorno a 40°C), così la paraffina si distende e si evitano le pieghe. Una volta che essa viene tirata fuori, si hanno il preparato e la fetta sul vetrino, che in seguito si deve asciugare. La si mette su una piastra a circa 30-35°C in maniera tale che l'acqua evapori e la fetta aderisca sul vetrino. L'adesione della fetta sul vetrino non è scontata, perché la fetta è fatta di paraffina, che non è molto compatibile con il vetro del vetrino. Allora, per evitare che la fetta si stacchi, bisogna prima preparare il vetrino: si deve spalmare una quantità infinitesimale di velo di una sostanza, ovvero l'albumina glicerinata (albumina: proteina del plasma), cioè una soluzione di albume e glicerina totalmente trasparente. È una colla naturale che non interferisce con alcun tipo di colorazione e che fa aderire la fetta al vetrino.

Al giorno d'oggi vi sono vetrini particolari per le sezioni di 4 μm, poiché sono le sezioni che tendono a staccarsi con più facilità: vengono chiamati vetrini polilisinati, sui quali è stato messo un velo monomolecolare di polilisina e dunque il vetrino si è caricato elettrostaticamente. Questo tipo di vetrino possiede un dritto, sul quale avviene questo tipo di trattamento e fa sì che la sezione venga attirata e fermata elettrostaticamente, e un rovescio e non interferisce con nessun tipo di colorazione.

Colorazione

Il sesto passaggio è la colorazione. Il 95% dei coloranti è idrosolubile, perciò la prima cosa da fare per colorare è togliere la paraffina che è idrofobica. Per toglierla si usa lo xylolo, così da far rimanere solo l'acqua. Si colora allora il vetrino. Di colorazioni ve ne sono di diversi tipi, ma la più comune in istologia è quella bicromica dell'ematossilina eosina. I coloranti, che agiscono tutti secondo il pH e che generalmente sono delle polveri che vanno diluite con acqua distillata e altri liquidi, colorano meglio.