Report tecnico scientifico di Microbiologia applicata - 6/6 punti

Report tecnico-scientifico Microbiologia applicata

Elaborato di

Bettero Simone

matricola 966109

Anno accademico 2022/2023

Contents

1 Introduzione 3

2 Materiali 3

3 Microbiologia generale 5

3.1 Terreni di coltura . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

3.2 Determinazione della carica totale dei batteri protecnologici dello yogurt 7

3.2.1 Introduzione e scopi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

3.2.2 Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

3.2.3 Risultati e commenti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

3.3 Coltura pura di un microrganismo ambientale: . 10

Bacillus licheniformis

3.3.1 Introduzione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

3.3.2 Risultati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

3.4 Caratterizzazione fenotipica di un isolato ambientale: 11

B. licheniformis

3.4.1 Introduzione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

3.4.2 Crescita di su agar latte e risultati . . . . . . 11

B. licheniformis

3.4.3 Crescita di su agar amido e risultati . . . . . 12

B. licheniformis

3.4.4 Valutazione dell’attività catalasica di . . . . . 13

B. licheniformis

3.4.5 Risultati finali sulla caratterizzazione fenotipica di B. licheni-

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

formis

3.5 Prova di utilizzo degli zuccheri dei batteri lattici: e

S. thermophilus L.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

delbrueckii subsp bulgaricus

3.5.1 Scopo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

3.5.2 Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

3.5.3 Risultati e conclusioni . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

3.6 Colorazione di Gram . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

3.6.1 Introduzione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

3.6.2 Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

3.6.3 Risultati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

4 Microbiologia industriale 20

4.1 Coltura dei batteri lattici . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

4.1.1 Introduzione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

4.1.2 Risultati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

4.2 Coltura di . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

Penicillium chrysogenum

4.2.1 Introduzione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

4.2.2 Risultati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

4.3 Coltura di . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

A. niger

4.3.1 Introduzione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

4.3.2 Risultati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

1

5 Microbiologia Alimentare 24

5.1 Analisi microbiologiche sulla carne macinata . . . . . . . . . . . . . 24

5.2 Carica batterica totale dei mesofili nella carne macinata . . . . . . . . 24

5.2.1 Introduzione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

5.2.2 Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

5.2.3 Risultati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

5.3 Carica batterica totale degli enterococchi nella carne macinata . . . . 27

5.3.1 Introduzione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

5.3.2 Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

5.3.3 Risultati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

5.4 Carica batterica totale delle nella carne macinata . 29

Enterobacteriaceae

5.4.1 Introduzione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

5.4.2 Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

5.4.3 Test di conferma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

5.4.4 Risultati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

5.5 Analisi microbiologiche su un alimento fermentato . . . . . . . . . . 32

5.6 Analisi degli enterococchi nel formaggio . . . . . . . . . . . . . . . . 33

5.6.1 Introduzione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

5.6.2 Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

5.6.3 Risultati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

5.7 Analisi dei mesofili nel formaggio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

5.7.1 Introduzione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

5.7.2 Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

5.7.3 Risultati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

5.8 Valutazione della presenza di spore di microrganismi mesofili dopo

pastorizzazione nel formaggio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

5.8.1 Introduzione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

5.8.2 Procedimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

5.8.3 Risultati . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

2

1 Introduzione

Durante il terzo anno di STAL triennale presso l’università Statale di Milano, ho avuto

l’opportunità di partecipare ai laboratori di microbiologia, una disciplina che ha sus-

citato in me un grande interesse fin dall’inizio del corso. Durante questi laboratori,

tenuti in diverse sessioni distribuite lungo l’anno accademico, abbiamo avuto modo

di approfondire la conoscenza di tre diverse branche della microbiologia: quella gen-

erale, attraverso quattro sessioni tra novembre e dicembre, quella industriale, in due

date a gennaio, e quella alimentare, durante il periodo compreso tra marzo e maggio,

anch’esso con un totale di quattro date. Sono stati creati quattro gruppi, e mi è stato

assegnato il quarto.

La professoressa Arioli è stata la nostra guida nella sezione dedicata alla micro-

biologia generale dove abbiamo imparato a conoscere i microrganismi e le loro carat-

teristiche, nonché i principali metodi di isolamento, identificazione e coltivazione dei

batteri.

Per quanto riguarda la microbiologia industriale, la nostra guida è stata la profes-

soressa Rollini. Grazie alle sue lezioni e alle esercitazioni pratiche, abbiamo appreso

come utilizzare i batteri per la produzione di sostanze di interesse industriale.

Infine, nella sezione dedicata alla microbiologia alimentare, abbiamo avuto l’opportunità

di lavorare con il professor Russo. Attraverso le sue lezioni e le attività di laboratorio,

abbiamo approfondito la conoscenza degli organismi che possono contaminare gli al-

imenti, delle malattie che possono causare e dei principali metodi di prevenzione e

controllo.

2 Materiali

I materiali più utilizzati durante queste esercitazioni sono stati:

• la pipetta, è uno strumento di precisione utilizzato per prelevare e trasferire con

precisione piccole quantità di liquidi. Esistno diversi tipi di pipette ma quelle

che abbiamo usato sono le pipette graduate che permettono di misurare con pre-

cisione una determinata quantità di liquido e sono disponibili in diverse capacità

di volume.

• La propipetta, invece, è uno strumento di misurazione molto preciso che con-

sente di prelevare e trasferire volumi estremamente ridotti di liquidi con una

precisione di alcuni microlitri. È composta da un dispositivo di aspirazione man-

uale e da una punta monouso che si adatta al volume da misurare. La propipetta

è considerata un dispositivo di sicurezza individuale.

• L’ansa, anche conosciuta come anello di inoculazione, è uno strumento di lab-

oratorio utilizzato in microbiologia per prelevare campioni di microrganismi da

una sorgente e trasferirli in un altro luogo, ad esempio in un terreno di coltura o

in un’altra soluzione, come uno slant.

• Lo slant è un tipo di provetta di coltura che viene utilizzato per la conservazione

e la coltura di microrganismi in laboratorio.

3

• Le spatole a ”L” ovvero degli strumenti molto utile per proseguire nello spatola-

mento di un microrganismo su un terreno di coltura. Queste vengono sterilizzate

prima dell’uso, per garantire che il campione raccolto sia privo di contaminanti,

lo stesso vale anche per le pipette e per l’ansa, e la sterilità la si mantiene anche

durante tutto il processo di inoculo grazie alla presenza del bunsen.

• La piastra di Petri è il più diffuso contenitore per terreni di coltura solidi e

semisolidi, di forma cilindrica con all’interno un terreno di coltura, che può es-

sere selettivo per un determinato microrganismo, ottenendo cosı̀ delle colture

pure. Su di esso possono poi essere coltivate colonie cellulari con diverse tec-

niche, come ad esempio lo spatolamento con le spatole ad ”L”.

• Il bunsen è uno strumento comunemente utilizzato in microbiologia per steriliz-

zare e riscaldare campioni e strumenti di laboratorio, come indicato precedente-

mente. Per utilizzare il bunsen in modo sicuro ed efficace, è necessario seguire

alcune precauzioni, come ad esempio regolare l’intensità della fiamma in base

alle necessità, si parla di fiamma ossidante o riducente, utilizzare sempre il bun-

sen in un ambiente ben ventilato e posizionarlo lontano da sostanze infiammabili.

• Il vortex è uno strumento utilizzato in microbiologia per agitare e miscelare cam-

pioni liquidi, ad esempio terreni di coltura o soluzioni contenenti microrganismi.

Il movimento circolare e intermittente del vortex produce una miscelazione rap-

ida e uniforme dei campioni liquidi, permettendo di mantenere in sospensione i

microrganismi presenti e garantendo una distribuzione uniforme delle sostanze

nutritive nei terreni di coltura. 4

3 Microbiologia generale

Nell’ambito della microbiologia generale sono stati svolti quattro laboratori, ciascuno

con un obiettivo specifico. Nel primo laboratorio, si è affrontata la diluizione decimale

di un campione di yogurt o del terreno, seguita dal piastramento, e piastramento di un

microrganismo ambientale per ottenere una coltura pura. Nel secondo laboratorio, si

sono analizzate le colonie ottenute nella prima esercitazione. Nel terzo laboratorio, si

è proceduto all’identificazione e alla caratterizzazione fenotipica di un isolato ambien-

tale, mentre nel quarto laboratorio si è monitorato il risultato ottenuto dalla precedente

esercitazione, e la colorazione di Gram.

3.1 Terreni di coltura

I terreni di coltura rappresentano un elemento cruciale per la crescita e la sopravvivenza

dei microrganismi, in quanto forniscono i nutrienti e le condizioni ambientali neces-

sarie per il loro sviluppo.

Tuttavia, non tutti i microrganismi possono essere coltivati nello stesso tipo di ter-

reno, in quanto ogni specie presenta esigenze specifiche in termini di pH, temperatura,

composizione chimica e fattori ambientali. Pertanto, per garantire una crescita ottimale

dei microrganismi, è necessario utilizzare differenti tipologie di terreni di coltura, cias-

cuno progettato per soddisfare le esigenze specifiche della specie di microrganismo

considerata. In questo contesto, nel seguito di questa sezione, verrà fornita una lista

esaustiva dei terreni di coltura utilizzati.

• M17 agar (Oxoid) (37°C, 48 h, aerobiosi), utilizzato

Streptococcus thermophilus

come mezzo parzialmente selettivo per impiegato nello studio

S. thermophilus,

dello yogurt.

• MRS agar (Oxoid) Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus (L. delbrueckii

(37°C, 48 h, anaerobiosi, pH 5,5), utilizzato per favorire la

subsp bulgaricus)

crescita di impiegato nello studio dello yogurt.

L. delbrueckii subsp bulgaricus,

• ROSA BENGALA (Scharlau) per muffe e lieviti (25°C, 5 giorni aerobiosi), nel

caso dello studio del terreno.

• Nutrient agar (Scharlau) utilizzato per i microrganismi ambientali poco esigenti:

(30°C

Bacillus licheniformis (B. licheniformis) e Pseudomonas putida (P. putida)

48 h, aerobiosi).

• Agar latte, per valutare la capacità di crescita di uno dei due microrganismi am-

bientali su questo terreno, ed anche per valutare la sua attività proteolitica, la sua

composizione è la seguente:

– latte scremato in polvere 5% (p/v) (Merck),

– agar 15 g/l (Merck),

– acqua distillata. 5

• Agar amido, per valutare la capacità di crescita di uno dei due microrganismi

ambientali su questo terreno, ed anche per valutare la sua attività amilolitica, la

sua composizione è la seguente:

– nutrient broth 8 g/l (Merck),

– amido solubile 10 g/l (Merck),

– agar 15 g/l (Merck)

– acqua distillata

• BSM per prova di fermentazione batteri lattici o isolato ambientale.

I terreni che sono stati utilizzati durante le quattro esercitazioni verranno trattati

meglio nei capitoli successivi, anche in relazione con i microrganismi usati.

6

3.2 Determinazione della carica totale dei batteri protecnologici

dello yogurt

3.2.1 Introduzione e scopi

La prima esercitazione, che si è tenuta il 4/11/2022, aveva come obiettivo l’analisi

della carica batterica in un campione di terreno o di yogurt. Nel mio caso, ho eseguito

l’analisi sulla carica batterica dello yogurt ”bio yogurt aus Heumilch” dell’azienda

Sterzing-Vipitero, un prodotto intero bianco biologico al fine di valutarne la qualità

microbiologica.

Lo yogurt è stato prodotto a partire dai batteri lattici e

S. thermophilus L. delbrueckii

e l’analisi mirava a determinarne la presenza, e soprattutto la quan-

subsp bulgaricus,

tità. Durante la conservazione, il prodotto è stato mantenuto a 4°C in modo da rispettare

la catena del freddo, e la data di scadenza è stata fissata al 25/11/2022.

L’analisi è stata effettuata prima di questa data e di conseguenza devono essere

7

presenti, per parametri di legge, almeno 10 UFC/g yogurt di e

S. thermophilus L.

vivi, vitali e coltivabili.

delbrueckii subsp bulgaricus

3.2.2 Procedimento

Per condurre questa valutazione è necessario eseguire il piastramento dei microrgan-

ismi su un terreno di coltura mediante il metodo delle diluizioni decimali. A tale scopo,

si è utilizzato 10g di yogurt e cinque provette contenenti 9mL di soluzione fisiologica,

ognuna delle quali etichettata con un numero (-2,-3,-4,-5,-6) per indicare il grado di

diluizione.

Dopo aver prelevato 1mL di prodotto con una pipetta, si è aggiunto il campione

alle provette e lo si è reso omogeneo con l’ausilio di un vortex. Questo passaggio è

stato ripetuto per tutte le provette, prelevando il campione dalla provetta precedente,

mantenendo la massima sterilità possibile, rimanendo, quindi, vicino alla fiamma del

bunsen e cambiando pipette