Microbiologia - Virus

METODI DI DIAGNOSI (DOMANDA)

Il quadro generale — i due approcci

La diagnosi virologica di laboratorio si articola in due grandi approcci: diretto, che identifica il virus (o sue

componenti) direttamente nel campione clinico, e indiretto (sierologico), che rileva nel siero la presenza di anticorpi

specifici. È indispensabile procedere alla diagnosi di laboratorio quando è prospettabile una terapia specifica, il quadro

clinico può essere sostenuto da più virus diversi, bisogna seguire pazienti immunodepressi, o si conducono indagini

epidemiologiche.

Ricerca diretta — metodi rapidi

Microscopia elettronica

Data la dimensione ridottissima dei virus (20-300 nm), servono elettroni al posto della luce visibile per visualizzarli. La

tecnica principale è la colorazione negativa, che permette una diagnosi in 15 minuti, con un’ottima risoluzione (2 nm).

Fu determinante, ad esempio, nell’identificazione del coronavirus della SARS. Limiti importanti: scarsa sensibilità

(serve una concentrazione di 10⁶-10⁷ particelle/mL, salvo eccezioni come feci o vescicole erpetiche, fino a 10¹¹/mL), alti

costi, necessità di personale specializzato. Per compensare si usano metodi di concentrazione (ultracentrifugazione) o

l’immunomicroscopia elettronica, che unisce anticorpi specifici alla visualizzazione — utile per rosolia, HBV, virus

di Norwalk.

Rilevazione di antigeni virali

Indicata soprattutto per virus con pochi sierotipi, grazie oggi alla disponibilità di anticorpi monoclonali ad alta

sensibilità. Le tecniche principali sono tre.

Immunofluorescenza (IF): anticorpi coniugati con fluoresceina, in versione diretta (l’anticorpo fluorescente reagisce

subito col campione — più semplice, ma serve un antisiero coniugato per ogni antigene) o indiretta (un secondo

anticorpo coniugato riconosce il primo — più sensibile). Applicazioni tipiche: cellule epiteliali di sfaldamento

respiratorio (RSV, coronavirus), cute/occhio (HSV, VZV), e — dato molto interessante — l’antigene pp65 del CMV

nei leucociti infetti, utile per monitorare infezioni sistemiche anche con basse quantità di virus circolante (es. durante

terapia antivirale), quando altre metodiche falliscono.

Immunoperossidasi (IP): concettualmente identica all’IF, ma la marcatura avviene con perossidasi di rafano invece

di fluoresceina, con lettura in microscopia ottica tramite reazione colorimetrica. Vantaggiosa su tessuti integri, perché

permette di vedere la relazione spaziale tra antigeni virali e strutture cellulari.

Saggi immunometrici in fase solida — ELISA e CLIA: sono la metodica più diffusa nei laboratori di virologia,

grazie alla versatilità (funzionano sia su antigeni cellulo-associati sia su campioni fluidi) e alla minore dipendenza

dall’integrità del campione. Il formato più comune è il test a sandwich: un anticorpo di cattura, adsorbito su un

supporto solido, lega l’antigene virale presente nel campione; un secondo anticorpo di rilevazione (marcato direttamente

o riconosciuto da un terzo anticorpo) rivela la reazione. La differenza tra le due tecniche sta nel sistema di rilevazione:

l’ELISA usa enzimi che producono un cambiamento colorimetrico misurabile per assorbanza; il CLIA usa invece una

molecola chemiluminescente, misurando l’intensità luminosa — risultando generalmente più sensibile dell’ELISA (i

test di 4ª generazione usano tipicamente la chemiluminescenza). Applicazioni: virus respiratori (RSV, influenza),

enterici (rotavirus), HBV, EBV, HIV.

Metodi molecolari — la rivoluzione della diagnostica

La rilevazione di acidi nucleici virali ha rivoluzionato la diagnostica, permettendo di identificare praticamente qualsiasi

virus, anche quelli difficili o impossibili da coltivare (HIV, HPV, poliomavirus, HBV, HCV) o a crescita lenta (CMV,

VZV, EBV). Un vantaggio cruciale: data la stabilità del DNA e la capacità di amplificarlo, queste tecniche funzionano

anche su campioni in quantità esigue o con vitalità cellulare compromessa — condizione frequente quando il

trasporto/conservazione del campione non è ottimale.

Si dividono in tecniche di amplificazione del bersaglio (PCR, RT-PCR, TMA) e di amplificazione del segnale

(Hybrid Capture).

PCR (Polymerase Chain Reaction): usa primer specifici, nucleotidi liberi e una DNA polimerasi termostabile, con

cicli ripetuti (30-45) di denaturazione-ibridazione-estensione in un termociclizzatore. Ha sensibilità altissima (1-10

copie di DNA target). Per i virus a RNA, prima dell’amplificazione serve la retrotrascrizione a cDNA (da qui il nome

RT-PCR), tramite trascrittasi inversa.

Real-Time PCR: perfezionamento che permette la quantificazione del materiale di partenza, rilevando il segnale

(fluorescenza da intercalanti o sonde marcate) durante la fase esponenziale dell’amplificazione, quando l’efficienza è

massima — a differenza della PCR end-point classica, che legge solo alla fine. Un parametro chiave da conoscere: il

ciclo soglia (Ct), cioè il ciclo in cui il segnale supera la soglia di rilevazione — inversamente proporzionale alla

quantità di materiale di partenza (Ct basso = molto virus nel campione). Applicazioni cliniche fondamentali: HIV

(qualitativa per diagnosi precoce/perinatale, quantitativa per monitorare terapia), HCV e HBV (stessa logica

qualitativa/quantitativa), HSV/VZV su liquor per encefaliti, CMV/EBV nei trapianti, JC virus su liquor per la

leucoencefalopatia multifocale, HPV per la determinazione del rischio oncogeno.

TMA (Transcription Mediated Amplification): tecnica più recente, basata su amplificazione isotermica (senza

necessità di cicli termici), applicata a HCV, CMV, HIV.

Ha senso — la PCR (e Real-Time PCR) è probabilmente il punto più “moderno” e clinicamente

rilevante di tutto il capitolo, quindi è ragionevole che la prof ci punti l’attenzione. Riprendiamo e

approfondiamo bene solo questa parte, in modo che tu la sappia esporre con sicurezza.

PCR e Real-Time PCR — DISCORSO DI APPROFONDIMENTO

Il principio generale

La PCR (Polymerase Chain Reaction) è il prototipo di tutti i saggi di amplificazione del bersaglio: permette di

moltiplicare artificialmente, fino a renderla rilevabile, una specifica sequenza di acido nucleico presente nel campione,

anche se inizialmente presente in quantità infinitesimali. È per questo che ha rivoluzionato la diagnostica virologica:

prima serviva molto virus per poterlo rilevare (pensiamo alla microscopia elettronica, che richiede 10⁶-10⁷

particelle/mL); con la PCR bastano 1-10 copie del DNA bersaglio.

Gli ingredienti della reazione

Per funzionare, la PCR richiede:

• Primer: corti oligonucleotidi sintetizzati per essere complementari a sequenze specifiche che fiancheggiano il

gene da amplificare (esterne ad esso). Sono loro a garantire la specificità della reazione — fungono da punto

di innesco per la polimerasi.

• Una miscela di nucleotidi liberi (i “mattoncini” da incorporare nella nuova catena)

• Una DNA polimerasi termostabile (capace cioè di resistere alle alte temperature dei cicli, senza denaturarsi)

I tre passaggi di ogni ciclo

Ogni ciclo di PCR si compone di tre fasi, a temperature diverse, controllate automaticamente da uno strumento

chiamato termociclizzatore:

1. Denaturazione: il DNA a doppio filamento viene separato in due filamenti singoli tramite riscaldamento

2. Ibridazione (annealing) dei primer: i primer si legano alle sequenze complementari sui filamenti singoli

3. Estensione: la DNA polimerasi allunga il filamento, incorporando nucleotidi a partire dal primer

Questo ciclo viene ripetuto 30-45 volte: a ogni ciclo, teoricamente, la quantità di DNA bersaglio raddoppia — è

proprio questa amplificazione esponenziale a rendere rilevabile anche una quantità di partenza minima.

Il caso dei virus a RNA — un passaggio in più= Se il virus da cercare ha genoma a RNA (es. HCV, HIV), prima di

poter fare la PCR è necessario un passaggio preliminare: l’RNA virale estratto dal campione deve essere

retrotrascritto in cDNA, grazie a un enzima con attività DNA polimerasica RNA-dipendente — la trascrittasi

inversa. Da qui il nome RT-PCR (Reverse Transcription-PCR). Solo dopo aver ottenuto il cDNA si procede con

l’amplificazione vera e propria.

Come si rilevano i risultati — PCR “end-point”

Nella PCR classica (end-point), il risultato si legge solo alla fine del processo di amplificazione (fase di plateau): i

prodotti finali, detti ampliconi, vengono visualizzati tramite elettroforesi su gel di agarosio, oppure tramite

ibridazione con sonde molecolari marcate.

Real-Time PCR — il perfezionamento quantitativo

È il metodo di PCR quantitativa oggi più utilizzato. La differenza fondamentale rispetto alla PCR end-point: qui la

rilevazione e quantificazione avvengono durante la fase esponenziale dell’amplificazione (quando l’efficienza è

massima), non alla fine. Questo si ottiene aggiungendo composti fluorescenti (intercalanti o sonde marcate), la cui

fluorescenza emessa a ogni ciclo è direttamente proporzionale alla quantità di materiale amplificato in quel

momento.

Il concetto-chiave da avere pronto: il ciclo soglia (Ct)

• Threshold (soglia): una linea scelta dall’operatore che separa il rumore di fondo dalla fase di amplificazione

realmente efficiente

• Ciclo soglia (Ct, Cycle threshold): il ciclo in cui il segnale di fluorescenza supera la soglia

• Il Ct è inversamente proporzionale alla quantità di materiale di partenza: più basso è il Ct, maggiore è la

quantità di virus presente nel campione (perché serve meno amplificazione per raggiungere la soglia)

Questo parametro è probabilmente il dettaglio più “clinico” e concreto: è quello che il laboratorio riporta materialmente

nel referto per quantificare la carica virale (es. monitoraggio della terapia in HIV, HCV, HBV).

Perché la Real-Time è preferita all’end-point

• Range dinamico di quantificazione più ampio

• Quantificazione più accurata (basata sulla fase di massima efficienza, non su un end-point dove i reagenti

potrebbero già essere esauriti)

• Automatizzabile, più rapida, meno soggetta a contaminazione da manipolazione post-PCR (non serve aprire le

provette per fare l’elettroforesi)

Applicazioni cliniche principali — utile avere pronti gli esempi

• HIV: qualitativa (diagnosi precoce, diagnosi perinatale nel neonato), quantitativa (monitoraggio della terapia

— la “carica virale”)

• HCV e HBV: stessa logica — qualitativa per la diagnosi, quantitativa per il monitoraggio terapeutico

• HSV e VZV: su liquor, per encefaliti/meningiti

• CMV/EBV: nei pazienti trapiantati, per la diagnosi di infezione sistemica

• JC virus: su liquor, per la leucoencefalopatia multifocale progressiva

• HPV: per determinare i genotipi ad alto/basso rischio oncogeno

Il filo conduttore da portare all’esame

“La PCR sfrutta primer specifici e una DNA polimerasi termostabile per amplificare esponenzialmente, tramite cicli

ripetuti di denaturazione-ibridazione-estensione, anche minime quantità di acido nucleico virale — per i virus a RNA,

previa retrotrascrizione a cDNA. La Real-Time PCR ne rappresenta il perfezionamento quantitativo, rilevando la

fluorescenza durante la fase esponenziale della reazione: il ciclo soglia (Ct) così ottenuto è inversamente proporzionale

alla carica virale del campione, ed è oggi lo strumento principale per la diagnosi e il monitoraggio terapeutico di

infezioni come HIV, HCV e HBV.”

Isolamento virale — il “gold standard”

L’isolamento virale è considerato il gold standard della diagnosi virologica, perché è l’unico metodo che consente di

isolare e propagare virus vivi, facilitandone rilevazione, caratterizzazione e conservazione. Oggi si effettua tramite

colture cellulari (i vecchi modelli animali e le uova embrionate sono ormai superati).

Vantaggi: a differenza dei metodi che usano reagenti virus-specifici (limitati al virus sospettato), la coltura permette di

isolare anche virus non sospettati o sconosciuti.

Svantaggi: tempi lunghi, e impossibilità di coltivare alcuni virus importanti (EBV, HBV, HCV, rotavirus, virus di

Norwalk, adenovirus enterici, HPV, parvovirus). Richiede inoltre grande perizia nella raccolta/trasporto del

campione — variabili che, insieme a una bassa carica virale, fanno sì che il risultato abbia valore solo in caso di

positività (una negatività non esclude l’infezione).

È particolarmente utile per HIV e CMV, ad esempio per rilevare l’infezione in neonati da madri infette o in pazienti

immunodepressi con scarsa produzione di IgM — casi in cui altri metodi sierologici falliscono.

La procedura

Prevede: inoculazione del campione in colture cellulari idonee → mantenimento delle colture (incubazione a 35-37°C, o

33°C per rhinovirus) → rilevazione della replicazione → tipizzazione. Alcuni campioni richiedono pretrattamento (es.

urine portate a pH neutro).

Come si rileva la replicazione — quattro modalità

1. Effetto citopatico (CPE): visibile al microscopio, compare da 1 giorno a 2-3 settimane a seconda del virus.

2. Rilevazione di antigeni virali sulle colture infette (stesse tecniche IF/IP/immunometriche viste prima, ma

applicate alla coltura anziché al campione diretto).

3. Emagglutinazione ed emadsorbimento: sfruttano glicoproteine di superficie di alcuni virus (influenza,

parainfluenza, morbillo) capaci di aggregare eritrociti — utili ma non specifiche, richiedono tipizzazione

successiva con anticorpi virus-specifici.

4. Attività enzimatica virus-specifica: es. dosaggio della trascrittasi inversa per HIV (oggi poco usato in

routine).

Metodi alternativi di tipizzazione: il test di neutralizzazione (un antisiero specifico neutralizza il CPE) e

l’interferenza virale (un virus “interferente” rende la coltura resistente a un secondo virus “challenge” — storicamente

usato per identificare il virus della rosolia, con un echovirus come challenge).

Indagini sierologiche

Un’infezione virale provoca tipicamente una risposta anticorpale, precocemente dosabile — da qui il ruolo centrale

della sierodiagnosi. Le IgM compaiono precocemente e scompaiono in settimane/mesi; le IgG seguono le IgM e

persistono per anni. La diagnosi si basa quindi sulla ricerca di IgM specifiche (indice di infezione recente/in atto),

oppure — quando questo non è possibile — sulla dimostrazione di un aumento del titolo anticorpale di almeno 4

volte tra un siero prelevato in fase acuta e uno in convalescenza (sieroconversione).

La sierologia è preferita alla ricerca diretta quando l’infezione non ha fasi viremiche importanti o quando la

produzione di virus/antigeni nel tessuto infetto è scarsa. Limite importante: la reattività crociata tra virus della stessa

famiglia può rendere difficile identificare il sierotipo esatto.

Le tre categorie di tecniche sierologiche

1. Saggi funzionali (storicamente importanti, oggi meno usati in routine):

• Test di neutralizzazione: misura la capacità degli anticorpi del siero di inibire il CPE indotto dal virus in

coltura — è considerato il gold standard sierologico, perché il titolo neutralizzante correla bene con la

protezione reale dall’infezione. Costoso e laborioso, quindi poco usato di routine.

• Inibizione dell’emoagglutinazione: gli anticorpi impediscono al virus di aggregare le emazie.

• Fissazione del complemento: gli anticorpi del siero, legandosi al virus, “sottraggono” il complemento a un

sistema indicatore (eritrociti + anticorpi anti-eritrociti), impedendone la lisi — un meccanismo indiretto ma

elegante.

2. Saggi su membrana:

• Western blot: gli antigeni virali denaturati vengono separati per elettroforesi e trasferiti su membrana, dove

reagiscono col siero in esame.

• Immunoblotting ricombinante: variante che usa proteine ricombinanti non denaturate, quindi riconosce

anche epitopi conformazionali.

• Questi saggi si usano tipicamente come conferma di un risultato di screening positivo (es. ELISA) — è lo

standard diagnostico per HIV e HCV, dove la conferma è sempre richiesta.

3. Saggi di legame (immunometrici): ELISA/RIA, concettualmente identici a quelli visti per gli antigeni, ma qui

l’antigene virale è adsorbito sul supporto solido e si cerca l’anticorpo del paziente. Sono i più diffusi nei laboratori, per

versatilità e automatizzabilità.

VIRUS ONCOGENI

§38.0

Prima di entrare nel dettaglio dei singoli virus oncogeni, è importante inquadrare il fenomeno della cancerogenesi in

generale, perché è proprio in questo processo che i virus si inseriscono come uno dei possibili fattori scatenanti.

Alla base della trasformazione neoplastica c’è sempre una disregolazione dei meccanismi che controllano

fisiologicamente la replicazione cellulare. Questa disregolazione deriva essenzialmente da due fenomeni:

1) la riduzione o la perdita della capacità della cellula di sottostare ai normali meccanismi che

regolano la proliferazione

2) e la riduzione o perdita della possibilità della cellula di andare incontro a morte cellulare

programmata, cioè l’apoptosi.

In pratica, una cellula neoplastica è una cellula che ha smesso di “ascoltare” i segnali che dovrebbero fermarla, e che

allo stesso tempo è diventata capace di sfuggire al meccanismo con cui l’organismo normalmente eliminerebbe una

cellula danneggiata o pericolosa.

Alla base di questa disregolazione ci sono danni a livello del genoma — mutazioni, delezioni, riarrangiamenti

cromosomici — che coinvolgono principalmente due categorie di geni.

- Da un lato gli oncogeni, cioè geni che, quando vengono attivati in modo anomalo, contribuiscono alla

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