Microbiologia

Microbiologia

Il nostro mondo è popolato da numerose creature che risultano essere invisibili ad occhio nudo, definite microrganismi o microbi, che rappresentano le prime forme di vita comparse sul pianeta. Queste appaiono come forme di vita unicellulari, autonome e, quindi, in grado di metabolizzare ed assumere dei prodotti dall’esterno, trasformarli e ricavarne dei nutrienti, energia ed eliminare prodotti di scarto. Inoltre, sono in grado di riprodursi, differenziarsi (molte volte lo fanno nei momenti di difficoltà, come, ad esempio, quando una cellula metabolicamente attiva si trasforma in spora, la quale risulta essere quiescente e vitale anche in condizioni ambientali avverse), evolvere, quindi trasformarsi, mantenere le trasformazioni e trasmetterle anche alla progenie, dotata di piccole dimensioni.

Lo studio della microbiologia

La microbiologia perciò studia tutti gli organismi invisibili ad occhio nudo e che possono essere visualizzati solo al microscopio, anche se alcuni batteri risultano avere delle dimensioni molto grandi. In altre parole, la microbiologia studia la diversità e l’evoluzione delle cellule microbiche, il come ed il perché siano comparsi differenti tipi di microrganismi. Di conseguenza, appare come una scienza che ruota attorno a due temi fondamentali:

• Comprendere la natura e i fenomeni del mondo microbico;
• Applicare la conoscenza del mondo microbico a beneficio delle necessità dell’uomo e del nostro pianeta.

Questi microrganismi di dimensioni piccolissime – di cui la microbiologia si occupa – comprendono virus, batteri, protozoi e funghi. La microbiologia studia tutte le cellule, il loro funzionamento (in particolar modo dei batteri, i quali rappresentano un elevato numero di microrganismi) ed il ruolo dei microrganismi nella società umana. Risulta avere anche un enorme impatto in numerosi campi: in quello medico ed alimentare, in immunologia, in agricoltura, in genetica e via discorrendo.

Impatto dei microrganismi

Sin dall’inizio del XX secolo, la principale causa di mortalità era rappresentata dalle malattie infettive, causate da patogeni. Tuttavia, la maggior parte dei microrganismi non rappresentano un danno per l’uomo, bensì risultano essere innocui, pertanto aiutano e possiedono benefici, come nell’agricoltura, che dipende in gran parte dall’attività microbica di molti microrganismi.

Uno dei maggiori rapporti è rappresentato dalle Leguminose, piante che vivono in stretta associazione con delle specie batteriche, che formano nelle loro radici delle strutture chiamate noduli. Qui l’azoto atmosferico N viene convertito in azoto fissato NH₃, che può essere utilizzabile direttamente dalle piante per il proprio sviluppo. In questo modo, l’attività che si esplica permette alle piante di poter utilizzare direttamente l’NH₃ – indispensabile per il loro sviluppo – e questo fa sì che si abbia la necessità di utilizzare il minor numero di fertilizzanti azotati, potenzialmente dannosi e nocivi.

Un altro esempio di microrganismi benevoli sono quelli che intervengono nel processo digestivo degli animali ruminanti. Questi hanno al loro interno un organo digestivo, il rumine, all’interno del quale i microrganismi compiono un processo di trasformazione nei confronti della cellulosa, grazie al quale essa viene digerita.

Un ulteriore esempio, nell’industria alimentare, è costituito dall’utilizzo di molti microrganismi per la lavorazione di prodotti caseari.

Per quanto riguarda l’energia, i microrganismi svolgono un ruolo primario: gran parte del gas naturale (metano CH₄) è prodotto dall’attività microbica di batteri metanogeni.

Molti microrganismi vengono anche utilizzati in un processo noto come bioremediation o biorisanamento, nel quale questi non fanno altro che trattare dei composti inquinanti derivanti dall’attività umana. Sono stati isolati moltissimi microrganismi in grado di degradare numerosi composti inquinanti, come petrolio, pesticidi e altri composti tossici sia per l’uomo che per l’ambiente.

Vengono utilizzate anche biotecnologie di microrganismi in numerosi processi industriali, come nel caso dell’insulina, un ormone generalmente sintetizzato a bassissimo livello nei soggetti diabetici, la quale può essere riprodotta microbiologicamente inserendo il gene umano dell’insulina ingegnerizzato in un microrganismo.

Storia della microbiologia

Benchè si sospettasse la presenza di creature invisibili ad occhio nudo, la loro scoperta avvenne grazie al naturalista olandese Antoni van Leeuwenhoek, il quale riuscì ad osservare i batteri per la prima volta. Inizialmente, ai tempi di Aristotele, si pensava che la vita si originasse dalla materia non animata, ma, tra la metà e la fine del XIX secolo, si è assistito ad uno sviluppo in cui crollò la teoria della generazione spontanea, anche grazie al chimico francese Louis Pasteur, uno dei maggiori oppositori a questa teoria. Egli predisse e scoprì che nell’aria erano costantemente presenti delle strutture molto simili ai microrganismi, trovati nel materiale che veniva lasciato all’aria che, dopo un certo periodo di tempo, andava in putrefazione.

Pertanto, concluse che questi microrganismi derivavano da cellule già presenti o dai microrganismi presenti nell’aria che si potevano depositare negli oggetti che andavano incontro a contaminazione. Pasteur si convinse, inoltre, che, trattando l’alimento in modo da distruggere tutti gli organismi viventi presenti, cioè rendendolo sterile, e proteggendolo da un’ulteriore contaminazione, si sarebbe potuta evitare la putrefazione. Egli usò il calore per eliminare i microrganismi contaminati e osservò che il forte riscaldamento di una soluzione nutritiva – seguito dalla sigillatura – ne evitava la putrefazione.

In particolare, per dimostrare questo, impiegò una fiasca a collo di cigno, quindi inserì all’interno di essa del liquido non sterile, stirò alla fiamma il collo della fiasca in modo tale da creare un imbuto poi, ponendo il liquido a riscaldare (per poterlo sterilizzare), lo fece andare in ebollizione; l’aria fuoriusciva successivamente ed il materiale non sterile veniva così sterilizzato. Inoltre, grazie al collo di cigno, tutti i microrganismi presenti nell’aria restavano intrappolati nella parte curva e non potevano venire a contatto con il liquido sterilizzato, talvolta per un elevato periodo di tempo. Dimostrò così che nell’aria erano presenti dei microrganismi e che, ruotando ed inclinando la fiasca, in modo tale da mettere a contatto il liquido sterile con la parte curva in cui erano presenti i microrganismi, in brevissimo tempo si sviluppavano nel liquido dei microrganismi.

Pasteur concluse che i microrganismi non si generano spontaneamente dalla materia inanimata o in decomposizione, ma si generano attraverso la replicazione di altri microrganismi. Se il cibo o altro materiale deperibile veniva lasciato riposare per qualche tempo, andava in putrefazione. Osservandolo al microscopio, questo materiale presentava una grande quantità di microrganismi.

Per quanto riguarda il luogo di provenienza di questi ultimi, alcuni sostenevano che si sviluppassero spontaneamente da materiale non vivente, considerazione dalla quale è nata la teoria della generazione spontanea dei microrganismi. Alcuni invece sostenevano che si generassero da germi o semi provenienti dall’aria.

Esperimenti storici

L'esperimento di Pasteur: nel punto C il liquido va in putrefazione poiché i microrganismi entrano insieme alla polvere. La curvatura della fiasca permette all’aria di entrare ma impedisce l’ingresso dei microrganismi, come dimostrato nel punto B. La dimostrazione che questi microrganismi fossero responsabili di malattie diede un grandissimo impulso a studi microbiologici successivi.

I primi studi furono eseguiti dal microbiologo tedesco Robert Koch, che studiò il carbonchio (o antrace), ovvero una malattia dei bovini causata dal bacillo sporigeno di Bacillus anthracis, il quale può occasionalmente trasmettersi all’uomo. Koch stabilì che, prelevando una quantità di sangue da un topo infettato e iniettando il sangue in un altro topo, questo contraeva la malattia e moriva. Dopo accurati studi di microscopia, dimostrò, quindi, che il batterio era sempre presente nel sangue degli animali morti di questa patologia. Sulla base di numerosi esperimenti, Koch formulò i seguenti criteri, denominati postulati di Koch, necessari per provare che un microrganismo è responsabile di una specifica malattia.

• Il microrganismo dev’essere costantemente presente negli animali che manifestano la malattia e non dev’essere presente negli animali sani;
• Il microrganismo deve poter essere prelevato dall’animale malato e coltivato in coltura pura al di fuori dell’organismo ospite;
• Le cellule provenienti da una coltura pura vanno poi inoculate in animali sani e suscettibili, per indurre poi tutti i sintomi caratteristici della malattia;
• Il microrganismo deve poter essere nuovamente isolato e ricoltivato in laboratorio, in modo tale da dimostrare che i microrganismi prelevati dal primo animale infetto ed inoculati nuovamente in un organismo suscettibile risultino essere gli stessi.

Dagli anni della Seconda guerra mondiale sono stati scoperti e classificati numerosi microrganismi, contribuendo perciò a migliorare la sistematica microbica e alla costruzione degli alberi filogenetici di organismi viventi. Dalla comparazione dell’rRNA sono state identificate 3 linee evolutive: due costituite da procarioti (Bacteria ed Archaea), mentre la terza dagli eucarioti (Eukarya). I microrganismi procariot dell’area Archaea sono maggiormente correlati agli eucarioti di quanto non lo siano ai batteri, dal momento che somigliano maggiormente ai primi piuttosto che ai secondi.

Caratteristiche cellulari

Le cellule procariotiche hanno una struttura molto semplice, mancante di organelli racchiusi da una membrana. Una caratteristica, invece, che distingue gli eucarioti è la presenza di organelli circondati da membrana, tra cui nucleo, mitocondri e cloroplasti, che risultano essere molto importanti nelle cellule fotosintetiche. Il nucleo è depositario dell’informazione genetica delle cellule, quindi racchiude il DNA, ed è il luogo dove avviene la trascrizione delle cellule eucariotiche. Mitocondri e cloroplasti, invece, svolgono un ruolo specifico: i primi sono produttori di energia e responsabili della respirazione; i secondi sono i responsabili della fotosintesi.

Procarioti

Ai procarioti appartengono i batteri e gli Archaea. Il dominio dei batteri contiene un’enorme varietà di procarioti e proprio questi rappresentano un phylum molto più grande del regno. Al suo interno si possono trovare microrganismi chemio-organotrofi, come Escherichia coli. In relazione agli Archaea, esistono due gruppi fondamentali: gli Euryarchaeota e i Crenarchaeota. Molti Archaea appartengono al genere Thermoproteus, i quali si sono adattati a vivere a temperature molto basse e a pH estremi; non tutti fanno parte di questo genere: alcuni vivono nel suolo, nei laghi e negli oceani, però poco studiati giacché sono molto difficili da coltivare.

Eucarioti

Le cellule eucariotiche sono generalmente di dimensioni maggiori rispetto ai procarioti e possiedono gli organelli circondati da membrana. Proprio per questo risultano avere una struttura molto più complessa rispetto a quella dei procarioti. Agli eucarioti appartengono alghe, funghi, protozoi e tutti quegli organismi cellulari quali piante ed animali.

Virus

I virus sono un’altra numerosa classe di microrganismi (non sono cellule!), pur non essendo dei sistemi dinamici e aperti, non essendo cioè in grado di assumere nutrienti, trasformarli, metabolizzarli e ricavarne energia. Oltre a ciò, non sono capaci neanche di espellere prodotti di scarto. Il virus è una figura statica, stabile ed incapace di cambiare e costruire i propri componenti. Sono in grado di riprodursi solo quando si trovano all’interno di una cellula, infettandola.

A differenza delle cellule, i virus non possiedono attività metaboliche proprie perché mancano di ribosomi, di conseguenza dipendono totalmente dal macchinario biosintetico cellulare per la sintesi proteica. Sono in grado di infettare qualsiasi tipo di cellule, anche quelle microbiche, e molti possono causare malattie. Tuttavia, queste reazioni virali possono determinare alterazioni genetiche in grado anche di migliorare le varie funzioni cellulari.

I virus possiedono delle dimensioni molto più piccole rispetto alle cellule, perfino di quelle procariotiche, tanto che il virus più piccolo ha addirittura un diametro di 10 nm (può essere visto solo al microscopio elettronico). Infatti, mentre le cellule si possono osservare al microscopio ottico, è possibile visualizzare i virus soltanto mediante microscopio elettronico. Ciò che si può notare al microscopio ottico è la cellula infettata, evento che determina la distruzione della cellula (infettata dal virus e morta in seguito) e la formazione di bolle trasparenti nella parte periferica delle colture cellulari oppure la formazione di placche, vale a dire delle zone di lisi (nelle colture cellulari i buchi sono derivati dalla distruzione delle cellule).

Tutti gli organismi cellulari sono altamente organizzati in strutture che mostrano una sorta di metabolismo. Le cellule attingono nutrienti dall’ambiente, li trasformano, conservano parte dell’energia ivi presente – in modo da poterla poi utilizzare – ed eliminano prodotti di scarto. In seguito, tutte si riproducono, nel senso che sono in grado di dirigere una serie di processi biochimici legati alla crescita ed alla divisione, per dare origine poi a due cellule figlie mediante scissione binaria. Molte cellule si differenziano mediante un processo durante il quale trasformano delle nuove sostanze e strutture (ad esempio le spore, coinvolte nella riproduzione, nella disseminazione e nella sopravvivenza).

Inoltre, le cellule rispondono a segnali esterni per via di fenomeni di chemiotassi: sono in grado di orientarsi, venendo calamitate da sostanze attraenti ed allontanate da sostanze repellenti (nocive) e, benché non si tratti di un fenomeno universale, spesso sono in grado di muoversi ed orientarsi grazie ad un’estroflessione che prende il nome di flagello. Infine, le cellule possono anche evolvere, cioè possono cambiare in modo permanente e definitivo le proprie caratteristiche, che vengono poi trasmesse alla progenie.

Il microscopio

La visualizzazione dei microrganismi richiede l’utilizzo del microscopio ottico o elettronico. In generale, il microscopio ottico si utilizza per osservare cellule intatte a basso ingrandimento, mentre per studi più dettagliati della struttura interna e della superficie della cellula si ricorre all’utilizzo del microscopio elettronico. Tutti i microscopi impiegano delle lenti per ingrandire l’immagine; è anche molto importante il potere di risoluzione, ossia la capacità di vedere ben distinti e separati due punti adiacenti. Il microscopio ottico ha un potere di risoluzione di circa 0,2 µm, quello elettronico una risoluzione 1000 volte superiore (0,2 nm). L’ingrandimento di un preparato è dato dal prodotto di ingrandimenti degli obiettivi e degli oculari. Il massimo ingrandimento di un oggetto al microscopio ottico risulta essere di 1500 volte.

Il microscopio ottico, che sfrutta la luce visibile, si può suddividere in diverse categorie comuni:

• In campo chiaro, che permette la visualizzazione dei campioni grazie alla differenza di contrasto (densità), presente tra i campioni ed il mezzo circostante. Ne consegue che maggiore è la densità (differenza di contrasto) tra il campione da analizzare ed il mezzo di contrasto, maggiore sarà la visualizzazione del campione in esame. Uno dei limiti della microscopia in campo chiaro risulta essere il contrasto, pertanto, per deviare questo problema, si utilizzano dei coloranti per cellule in modo tale da migliorarne il punto di contrasto;
• A contrasto di fase;
• In campo oscuro;
• A fluorescenza.

I coloranti

I coloranti derivano da composti organici; alcuni risultano essere caricati positivamente, infatti, per questo, vengono chiamati coloranti basici e reagiscono con elementi cellulari a carica negativa (come, ad esempio, polisaccaridi ed acidi nucleici). È un esempio il blu di metilene, che colora le cellule di blu.

Le colorazioni semplici si effettuano su preparazioni di sospensioni cellulari prima essiccate al calore poi ricoperte per qualche minuto con una soluzione colorante, dopodiché viene risciacquato il colorante per varie volte e vengono asciugati alla fine. Subito dopo si osservano i preparati con obiettivi a grande ingrandimento. Talvolta, per utilizzare quello massimo, il 100x, bisogna mettere una goccia di olio da immersione in modo tale da poter visualizzare il preparato correttamente.

Le colorazioni differenziali sono così chiamate perché colorano in modo diverso le cellule: ne è un esempio la colorazione Gram. In base alla reazione a questo tipo di colorazione, i batteri si possono dividere in Gram-positivi e Gram-negativi. In seguito alla colorazione, i Gram-positivi avranno una colorazione porpora-violetto, mentre i Gram-negativi una colorazione rosa. La differente colorazione è dovuta alle diverse strutture della parete cellulare dei batteri. L’etanolo è in grado di decolorare i batteri Gram-negativi, ma non è in grado di decolorare quelli Gram-positivi.

Dunque, inizialmente si hanno dei batteri che, per essere visualizzati al microscopio, devono essere colorati: in questo modo si può definire anche se si tratta di Gram-positivi o Gram-negativi. Successivamente si prende il campione e si pone in un vetrino, si fissa con il calore, si colora il campione con del cristal-violetto e, infine, si può decolorare velocemente con l’etanolo. A questo punto si possono osservare le cellule e classificare in Gram-positive (se non si decolorano) o Gram-negative (se si decolorano).