Microbiologia: sistemi di coltivazione e DNA

Coltivazione dei microrganismi

I mo chemioeterotrofi sono coltivati con piastre Petri a 3 settori in cui è contenuto il terreno di coltura → ha ciò che è sufficiente a garantirne la crescita; le piastre contengono uno strato di gel su cui seminare le cells microbiche x consentirne la crescita.

Il contenitore deve essere diviso in 3 sezioni e la semina avviene 2° un andamento a zig zag.

La sostanza depositata è una sospensione liquida torbida e lo strumento che si utilizza per fare lo striscio superficiale è l’ansa = una bacchetta di acciaio che termina con filo di Fe con un anello in fondo; la parte terminale è usata x toccare i mo e trasferirli sulla superficie.

Si utilizza un andamento a zig zag stretto → si deposita in maniera non omogenea fino ad arrivare a depositare una cell ogni tanto → si garantisce l’isolamento di una colonia.

Il contenitore viene chiuso. Dopo l’incubazione, la cellula isolata cresce e aumenta di numero e si noterà:

• Una crescita di strisce dove sono state depositate tante cellule vicine;
• Dove si è depositata la singola cellula si avrà un num di cells tale che diventerà visibile all’occhio colonia.

⇒ Così è possibile avere la separazione fisica dei vari ceppi di batteri.

Agar

Il terreno di coltura è una soluzione acquosa in cui è sciolto ciò che serve al mo x crescere; il terreno è reso solido grazie all’agar → poliss estratto dalle alghe che permette di dare al terreno una consistenza di gel.

L’agar è un substrato non utilizzato come fonte di sostanza organica.

Se bisogna utilizzare qualcosa che renda solido il terreno è opportuno che esso non venga utilizzato come fonte di C ed E → verrebbe metabolizzato e con la crescita dei mo diventerebbe liquido.

Inoltre non interferisce con le altre sostanze che sono disciolte nel terreno e sul pH della soluzione.

L’agar viene add a una concentrazione di 15 g/L nei terreni e per scioglierlo si deve scaldarlo: si scioglie quando la si porta a 100°C e solidifica a temperature inferiori ai 40°C.

Altri metodi di coltivazione

Un altro modo per coltivare mo è quello di spatolarli sulla sup con una spatola x distribuire in modo omogeneo un volume ben preciso.

Dopo l'incubazione si possono avere tante colonie separate, se:

• Il num di mo è basso ho un n° + piccolo di colonie;
• Il n° è + alto si hanno + colonie.

Al di sopra di un certo numero di cell non si può avere possibilità di vedere colonie separate ma una crescita di tipo confluente.

Se la soluzione microbica viene diluita il num di colonie sarà inferiore e + distinguibile.

Il terreno è poi lasciato solidificare incubandolo capovolto → evito che si formi condensa a causa del calore sotto forma di goccioline → se ricadono sul terreno formano uno strato sottile di acqua e le cellule non sarebbero + visibili.

Se si capovolge la piastra, la condensa esce dagli spazi tra il coperchio e il fondo e non disturba la crescita dei mo. Inoltre, il coperchio non ha una chiusura ermetica perché si decide solo in seguito se l'aria deve essere con o priva di O2.

Nella coltura dei mo non devo avere altri microorganismi nel terreno = sterile trattato con trattamenti termici x garantire ciò.

Descrizione della colonia

Le colonie hanno dimensioni, forme, spessori, margini (liscio, ondulato, filamentoso) variabili.

È importante descrivere e riconoscere una colonia perché quando si procede con l'isolamento del mo ci si aspetta di ottenere colonie = alle descrizioni che si avevano all'inizio.

Dal primo passaggio di isolamento si ottiene una coltura tutta uniforme e successivamente si fanno ulteriori controlli rifacendo l'isolamento per assicurarsi che la coltura sia di un solo ceppo, (quello scelto inizialmente).

Formulazione del terreno di coltura

X poter nutrire una cellula microbica è necessario conoscere la sua composizione: componente princ è il C, ossigeno, l’azoto, l’idrogeno e il fosforo.

Il criterio x decidere che tipo di fonte di C/N/vit/sali dare devono tenere conto di quali mo bisogna isolare.

La scelta della fonte di carbonio comprende la selettività basata sulla capacità dei microrganismi di utilizzare/degradare le fonti. Se:

• Si utilizza dell’amido i mo x poter crescere devono possedere gli enzimi necessari a degradarlo;
• Si forniscono zuccheri semplici (glucosio), solo i batteri che riescono a idrolizzarlo possono usarlo;
• Si fornisce il lattosio si è ancora + selettivi.

Tra le componenti della cellula è presente in grande quantità il P (più o meno metà dell'azoto) → è presente nel DNA e nella memb cell (fosfolipidi), è fornito sotto forma di sali.

Importante x poter crescere e originare la cell figlia cellula (replicare il proprio cromosoma).

Lo S è altrettanto presente perché è presente nelle proteine negli amminoacidi solforati.

Ogni fonte serve x favorire la crescita dei mo o x essere utilizzata come base per la costruzione.

In un terreno agarizzato sono sempre presenti una fonte di: C, N e di P.

Le esigenze dei batteri sono diverse: non tutti necessitano dello stesso zucchero → mo usano glucosio e altri non lo sanno usare.

Il fatto di riuscire a utilizzare una fonte o no dipende dalla disponibilità degli enzimi necessari al suo trasporto o alla mancanza di info a livello cromosomale.

Curva di crescita di un microrganismo

Grafico 1 → rapporta il num di cells in funzione del tempo. Graficamente è una linea curva che poi si impenna quando si hanno tantissime cellule.

Grafico 2 → permette di vedere che la fase esponenziale della crescita viene identificata come una retta.

È possibile calcolare così il num delle generazioni o il tempo di generazione.

Conoscere il tempo di duplicazione è importante se si variano le condizioni e l'ambiente per controllare lo sviluppo dei mo e capire come si altera (shelf-life).

Questa formula non è utilizzabile x il meccanismo di riproduzione dei lieviti e delle cellule eucariotiche.

Fasi di crescita

Ci sono 4 fasi di crescita:

• Fase di latenza = il mo si adatta all'ambiente; le cellule utilizzate x la coltura possono essere vecchie e quindi non posseggono il bagaglio enzimatico già pronto nel momento in cui vengono messe nel terreno.

Trovare e formare i giusti enzimi richiede energia e tempo ↓ le cellule si adattano e capiscono cosa serve per crescere vedendo cosa è presente nell'ambiente.

Possono poi iniziare la traduzione e la trascrizione → questa fase ha una durata variabile:

• Può durare gg / mesi in cellule che non sono in grado di duplicarsi;
• Può non esserci → quando le cellule sono in fase di crescita esponenziale perché si sono già adattate;
• La fase esponenziale = coincide con l'inizio della duplicazione con vel cost ma varia a seconda delle condizioni in cui il mo si trova, il tempo di generazione è costante.

Es. lo Streptococcus possiede un ideale di temperature di 42°C; a 30°C lavora molto - velocemente → la curva è - inclinata (+ sdraiata).

Tutto è link all'ambiente ottimale e alle capacità di adattamento.

• Fase stazionaria = non si ha + la duplicazione (= non c'è + crescita) cost ma le cells muoiono e se ne formano di nuove.

Il rapporto delle cellule vive e delle cellule morte è costante.

Questa fase è variabile tra specie e specie e in base alle condizioni.

Perché le cells smettono di duplicarsi?

È finita una fonte che stanno usando e non possono + duplicarsi;

• Il prodotto finale del metabolismo del mo è tossico x la cell stessa;
• Acido lattico abbassa pH latte e interferisce neg sull'attività degli enzimi → implicati nel metabolismo energetico;
• Non si ha + pH favorevole = diminuisce attività fino ad arrestarsi;
• Cambiamenti di T;
• Accumulo CO2;
• Fase di morte/di declino: la duplicazione = ho + cells morte che vive → la morte delle cellule diventa esponenziale.

Questa fase è influenzata dal tipo di mo e dalle condizioni con cui vengono coltivati.

Dopo la fase stazionaria c'è la possibilità di avere nuovamente una fase di crescita: il mo trova un'altra fonte presente in bassa concentrazione e la utilizza.

Metodi di misurazione della crescita

In laboratorio x misurare la concentrazione delle cellule esistono metodi diretti o indiretti:

• Diretti = quantificare direttamente i microorganismi;
• Indiretti = non si riesce a dire il numero esatto di cellule (valore preciso).

Tra i metodi indiretti si trovano la misurazione del peso totale cellulare: se aumenta il num di cells, aumenta anche il peso della biomassa → misura il peso umido e il peso secco della biomassa.

Come? Si utilizza un fermentatore con del terreno di coltura liquido: man mano che le cells crescono il terreno diventa torbido.

Le cellule presentano una densità > del terreno, tendono a sedimentare, ed è necessario fare delle centrifughe → è possibile recuperare sul fondo tutta la biomassa delle cellule separandola dalla parte liquida, così misuro il peso umido allontanando la parte del terreno.

È un parametro non molto accurato perché dipende dall'efficienza con cui avviene la separazione.

Si inserisce il composto (peso secco) in una stufa a circa 100°C così acqua evapora.

Il limite di questo metodo è che non si misura la quantità di cellule ma un incremento di massa, = non si ha una reale quantificazione e la distinzione tra vivo o morto.

La conta al microscopio

La conta al microscopio avviene grazie all'utilizzo di un sistema di vetrini che consente di creare una camera di conta.

= Si usa di un vetrino con delle scanalature con aree e sup definite.

Come si fa? Una goccia del campione viene messa sul vetrino che ricopre un’area e posizionato un vetrino copri oggetto → si forma uno spazio, forma un’altezza ben definita e si parla di volume.

I vetri sono così disegnati affinché ogni volta che conto delle cells in uno spec quadrato conosco il volume in cui esse si trovano = conto le cells e ottengo (con conversione) il risultato in cells x ml.

Quando conto ottengo anche il volume = densità cellulare → n° di cells x unità di volume.

Pro: conto direttamente le cells.

Contro: le cells sono piccole e ne conto una piccola quantità sul tot in sospensione → x avere stima corretta dei m.o. che sto contando devo spostarmi in + punti dell'area del vetrino x avere poi una media e una deviazione standard → devo contare tante zone x avere un numero + vicino alla realtà.

Ho 2 limiti:

• Se la densità cellulare è inferiore a 10⁵ cells x ml non riesco a contare → ho 0,1 o 2 cells x ogni campo che vado a contare, ovvero ho cells troppo diluite e non riesco a quantificare e avere un numero;
• In una popolazione non distinguo quali sono le cells vive da quelle morte, Why? Sono identiche ↓ Molte specie batteriche non sono mobili e le cells sono mobili quando sono giovani = no parametro.

La conta vitale (metodo diretto)

Metodo ufficiale nei laboratori x quantificare in risposta a delle leggi / normative che consente di contare in maniera efficiente e accurata le cellule.

Conta vitale = conta dei mo vivi in grado di generare colonie una volta che sono stati seminati sul terreno di coltura → conte le colonie (UFC): unità di misura.

Si parla di unità formanti colonie perché non tutte le colonie hanno lo stesso num di cellule: da una cell non si ottiene sempre una colonia (dipende dall'unità che dà origine alla colonia).

Il procedimento prevede delle diluizioni del campione: si muovono volumi noti diluendo in volumi noti.

Preparo una sospensione di campione, peso un campione e lo diluisco x mandare le cells in sospensione (tutto in una beuta) → questa sospensione è imp xché devo pesare quantità di alimento e add diluente.

Es. 10 g add diluente x arrivare a 100 g → 1:10.

Si preleva 1 mL della mia sospensione in una provetta e lo diluisco a una provetta che contiene 9 mL di un diluente.

Perché 9 ml? In modo da creare una diluizione che contiene 10 volte - il num di mo iniziale.

Se la beuta iniziale presenta 10⁵ UFC/mL e si preleva 1 mL (10⁵ UFC), lo put in una provetta con un volume di 10 ml, la concentrazione finale sarà di 10⁴ UFC/mL; se si preleva 1 mL